低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）是近年發(fā)展起來 的新一代肝素類抗血栓藥物，其抗血栓作用優(yōu)于肝素，而抗凝血作用低于肝 素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、體內(nèi)半衰期長、出血傾向小 等優(yōu)點，目前已廣泛應用于臨床。根據(jù)LMWH的來源、生產(chǎn)工藝、末端結構 的不同，LMWH分為許多不同的種類，如達肝素鈉、依諾肝素、納肝素鈣、 帕肝素鈉、汀肝素鈉等。達肝素鈉（Dalteparin Sodium）是低分子肝素的一 種，由亞硝酸降解肝素得到，重均分子量5600-6400，峰位分子量6000，硫 酸化程度為2.0-2.5/雙糖單位[1]。

達肝素鈉的生產(chǎn)過程中使用了亞硝酸，而亞硝酸根是一種毒性物質(zhì)，在 人體特定的環(huán)境條件下，可以合成一種很強的化學致癌物——N-亞硝基化合 物，能夠誘發(fā)幾乎所有內(nèi)臟器官的腫瘤。因此，檢測達肝素鈉中殘留的亞硝 酸根含量，對保證患者用藥安全具有重要意義。目前歐洲藥典使用離子色譜安培檢測法測定達肝素鈉中亞硝酸根含量[2]，國內(nèi)低分子肝素標準中使用化學 方法對亞硝酸根進行限度檢查，無含量測定[3]。歐洲藥典的方法未對樣品進行 前處理，達肝素鈉保留在色譜柱上，縮短柱壽命，且重現(xiàn)性較差。本文建立 了離子色譜法分離、電導檢測器檢測達肝素鈉中的亞硝酸根含量的方法，靈 敏度高，線性、回收率、重現(xiàn)性好，可以延長色譜柱壽命。

測試條件
儀器：戴安ICS 3000離子色譜系統(tǒng)（EG淋洗液發(fā)生裝置）； 分析柱：IonPac AS19，250×4 mm； 保護柱：IonPac AG19，50×4 mm； 柱溫：30 ℃； 淋洗液：氫氧化鉀（KOH） 梯度淋洗；5-40 mmol/L KOH，0-35 min； 40-5 mmol/L，35-35.1min； 流速：1.00 mL/min； 定量環(huán)：100 µL 抑制器：AMMS 4 mm，再生液為25mmol • L-1硫酸
檢測方式：抑制型電導

樣品前處理
精密稱取達肝素鈉0.4 g，加水溶解并稀釋至10 mL。 精密量取1 mL至離心管中，加無水乙醇9 mL，搖勻， 10000 r • min-1離心20 min。取上清液，過0.22 µm濾膜， 續(xù)濾液進樣。

結果和討論
樣品前處理條件的選擇
由于達肝素鈉是多羥基的多糖類物質(zhì)，堿性條件下離 子化，在離子交換柱上有很強的保留，即使使用強的洗脫 溶液如1 mol • L-1氯化鈉也很難將其洗脫。達肝素鈉侵占色 譜柱中的位點，可造成色譜柱容量下降，離子保留時間縮 短。去除待測液中的達肝素鈉后進樣，可解決這一問題。
去除達肝素鈉的方法主要有乙醇沉淀、陽離子表面活 性劑沉淀、超濾、透析等。陽離子表面活性劑的引入，會 降低色譜柱的柱效；超濾膜可能含有亞硝酸根殘留，影響 測定結果；透析需要的時間較長。與以上三種方法相比， 醇沉操作簡單、快捷，重現(xiàn)性好，且不易引入雜質(zhì)，因此 本方法選用醇沉法對樣品進行前處理。

色譜柱的選擇
樣品溶液含有的陰離子，除達肝素鈉正常含有的硫 酸根、殘留的亞硝酸根外，還含有氯離子、磷酸根離子 及其他未知陰離子。分別使用IonPac AS11-HC，IonPac AS15，IonPac AS19，IonPac AS23等色譜柱進行分離。 在氯離子和亞硝酸根之間出現(xiàn)未知色譜峰，保留時間與亞 硝酸根接近。降低淋洗液濃度，可增加未知峰與亞硝酸根 的分離度，但同時也造成分析時間延長。比較以上不同色 譜柱的測定結果，在保證未知峰與亞硝酸根分離度的前提 下，IonPac AS19色譜柱的分析時間短，亞硝酸根出峰 時間可控制在10 min以內(nèi)。IonPac AS19色譜柱良好的分 離效果與其高容量有關。

抑制模式的選擇
使用電導檢測器時，淋洗液有很高的檢測信號。抑 制器可降低淋洗液的背景電導，增加被測離子的電導 值，改善信噪比。常用的抑制模式有化學抑制、電抑制 等。測定陰離子時，化學抑制使用酸作為再生液；電抑 制使用外接水或電導池后流出的廢液作為再生液。本方 法的待測溶液中含有高濃度的乙醇，在電抑制模式下， 乙醇有響應且會干擾亞硝酸根的測定，而化學抑制模式 下乙醇無響應值。因此，本法采用25 mmol • L-1硫酸作為 再生液，選用膜抑制器化學抑制。

重現(xiàn)性、線性和靈敏度
取樣品溶液分別進樣6次，保留時間RSD為0.1%，峰 面積RSD為0.5%. 線性范圍 取25～1000 µg • L-1亞硝酸根標準溶液進 樣，以峰面積A對濃度C進行回歸計算，回歸方程為： A=0.000787C+0.001007, r=0.9997 取20μg • L-1的亞硝酸根標準溶液進樣，測定其峰高 微0.060 µS，按照3倍信噪比計算其檢測限為1 µg • L-1，按 照10倍信噪比計算其定量限為3.3 µg • L-1。

實際樣品分析及加標回收
精密稱取樣品適量，精密量取標準溶液適量加入， 分別制成加標濃度為25，50，100，200 µg • L-1的溶液， 回收率分別為98.5%～107.9%（n=3），見表1。

結論
綜上所述，本文建立的亞硝酸根的測定方法，不僅 操作簡單，靈敏度高，更具有重現(xiàn)性高，更好的保護色 譜柱等優(yōu)點。本方法不僅可用于低分子肝素的質(zhì)量控 制，其前處理方法和檢測方法也適用于其他多糖類藥物 中的陰離子測定。