1.定義

免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一種檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來(lái)，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的*靈敏性而建立的一種微量抗原檢測(cè)技術(shù)。其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來(lái)放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。

用抗體檢測(cè)抗原是免疫學(xué)的zui基本方法，用酶或同位素標(biāo)記抗體可使檢測(cè)的敏感性提高，常用的定量檢測(cè)方法ELISA和RIA均基于標(biāo)記分子可以使檢測(cè)的信號(hào)增強(qiáng)。免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的新方法，用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強(qiáng)的放大能力，其可以定量地檢測(cè)DNA和RNA,具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過(guò)連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，由此定量檢測(cè)抗原使敏感性高于ELISA和RIA。

2.基本原理

免疫PCR是用一段已知DNA分子標(biāo)記抗體作為探針，用此探針與待測(cè)抗原反應(yīng)，PCR擴(kuò)增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA分子，電泳定性，根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無(wú)，來(lái)判斷待測(cè)抗原是否存在。免疫PCR是迄今zui敏感的一種抗原檢測(cè)方法，理論上可以檢測(cè)單個(gè)抗原分子，但實(shí)踐中它的敏感性受許多因素的影響，如連接分子、顯示系統(tǒng)的選擇、DNA報(bào)告分子的濃度、PCR循環(huán)次數(shù)等。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道免疫PCR的敏感性一般比現(xiàn)行的ELISA法高102-108倍。由于PCR產(chǎn)物在抗原量未達(dá)到飽和前與抗原抗體復(fù)合物的量成正比，因此免疫PCR還可用于抗原的半定量試驗(yàn)。

免疫PCR主要由兩個(gè)部分組成：

*部分的免疫反應(yīng)類(lèi)似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的測(cè)定過(guò)程；

第二部分即通常的PCR檢測(cè)，抗原分子的量zui終由PCR產(chǎn)物的多少來(lái)反映。

*步中，首先用待測(cè)抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19（質(zhì)粒DNA） （Biotin-pUC19）中的生物素反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。

接下來(lái)，就是第二步中的PCR過(guò)程，*步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時(shí)內(nèi)而放大數(shù)百萬(wàn)倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。

PCR由：①待測(cè)抗原；②生物素化抗體；③親和素（連接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR擴(kuò)增五部分構(gòu)成。

（1）待檢抗原

被檢測(cè)的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過(guò)程與ELISA試驗(yàn)是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的免疫PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，需要對(duì)免疫PCR進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠檢測(cè)吸附性差的抗原。免疫PCR的后續(xù)過(guò)程需PCR擴(kuò)增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是特殊用于免疫PCR,并且有些PCR僅可以直接用微量板進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程和提高檢測(cè)的性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測(cè)微量抗原。

（2）特異抗體

免疫PCR中的特異抗體是對(duì)應(yīng)于待檢抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個(gè)抗體常采用生物素標(biāo)記，通過(guò)親和素再結(jié)合DNA。

（3）連接分子

連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。目前介紹的方法中均是通過(guò)生物素與親和素系統(tǒng)使特異抗體與DNA連接，生物素和親和素作為免疫PCR的連接分子在連接方式上有許多差異。Sano報(bào)道PCR時(shí)用的是重組葡萄球菌A蛋白-親和素嵌合蛋白（SPA-親和素）。其具有結(jié)合IgG和生物素的兩個(gè)位點(diǎn)，因此可以將IgG與生物素化的DNA連接成復(fù)合物。由于重組的SPA-親和素沒(méi)有商品試劑，且SPA不但可以結(jié)合特異抗體的IgG,而且還可以與樣品中吸附于固相的無(wú)關(guān)IgG結(jié)合，特別是檢測(cè)的抗原就是某種IgG，因此，Ruzicke認(rèn)為Sano的免疫PCR本底高和特異性差。Ruzicke用商品化的親和素系統(tǒng)試劑建立了一種免疫PCR，這種方法是先將親和素與生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物，然后再與結(jié)合固相的特異性抗體結(jié)合，這種方法存在的問(wèn)題是親和素與生物素化的DNA分子預(yù)結(jié)合時(shí)二者的分子比例并不是等同的，一個(gè)親和素分子可以結(jié)合4個(gè)分子生物素，因此在預(yù)結(jié)合時(shí)生物素化的DNA分子不能過(guò)多，否則DNA分子上的生物素將親和素*飽和，親和素再無(wú)結(jié)合生物素化抗體的能力；但在低飽和生物素化DNA時(shí)，親和素結(jié)合的生物素化DNA存在許多種類(lèi)的復(fù)合物，甚至還有游離的親和素，只有部分結(jié)合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用，因此，這樣預(yù)結(jié)合的親和素和生物素化DNA是一均質(zhì)性很差的混合物。雖然預(yù)結(jié)合的復(fù)合物可以減少測(cè)試過(guò)程中的1次孵育和沖洗，但是這樣的復(fù)合物作為連接分子必然導(dǎo)致敏感性低和誤差大，并且每次制備的連接分子均有差異，從而導(dǎo)致重復(fù)性差。

Hong zhou等建立了一種免疫PCR方法，連接分子是鏈親和素，在連接抗體和DNA時(shí)是以游離的方式加入，這樣鏈親和素先與生物素化抗體結(jié)合，沖洗后，再加入生物素化的DNA.這個(gè)方法雖然多了1次孵育和沖洗過(guò)程，但具有較好的敏感性和重復(fù)性。

（4）DNA和PCR系統(tǒng)

免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測(cè)抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是應(yīng)用了PCR強(qiáng)大的擴(kuò)增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA,但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA.一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。DNA的生物素化是用生物素標(biāo)記的dATP或dUTP通過(guò)DNA聚合酶標(biāo)記在DNA分子上，一般是一個(gè)分子DNA標(biāo)記兩個(gè)生物素，標(biāo)記率可達(dá)。生物素化的DNA用量需預(yù)先選定，過(guò)多易出現(xiàn)非特異結(jié)合而引起本底過(guò)高，過(guò)低將導(dǎo)致敏感性低和出現(xiàn)不同濃度抗原得出同樣結(jié)果的飽和現(xiàn)象。

免疫PCR的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，同時(shí)又需要對(duì)固相結(jié)合的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，因此，免疫PCR固相的選擇應(yīng)根據(jù)具體情況確定。用微量板作為固相必須有配套的PCR儀，以使可以用微量板直接擴(kuò)增，否則需要用PCR反應(yīng)管作為固相擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小選擇兩種凝膠的濃度。電泳后凝膠經(jīng)染色和拍照記錄結(jié)果，再檢測(cè)底片上PCR產(chǎn)物的光密度，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較就可以得出待檢抗原量。

提示：本文免疫PCR的基本原理屬于PCR技術(shù)文章，主要介紹免疫PCR方面的知識(shí)，內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)交流與參考

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