盡管*個(gè)microRNA是在1993年發(fā)現(xiàn)的，但直到zui近幾年，人們才開始了解這種小RNA分子的大作用。miRNA通過與轉(zhuǎn)錄本的相互作用，關(guān)閉或抑制基因的表達(dá)。zui近的研究表明它們影響了約三成的基因。miRNA在多個(gè)組織中差異表達(dá)，這就讓表達(dá)圖譜分析成為研究的重點(diǎn)。同時(shí)，miRNA的過表達(dá)和抑制也是近年來常用的研究方法。

然而，miRNA很小，這就增添了研究的難度。如何繪制靈敏而特異的表達(dá)譜？如何上調(diào)或下調(diào)特定的miRNA？如何驗(yàn)證結(jié)果？全靠自己摸索，體會是很深，但時(shí)間也花不少。收集了來自*研究院的專家的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，這將讓你少走彎路。

Q1：你使用什么方法來確保靈敏而特異的miRNA表達(dá)譜？為什么？

Galina Gabriely（哈佛大學(xué)）

我們通常利用多重定量PCR來對少量的人miRNA進(jìn)行小規(guī)模圖譜分析。這種方法的靈敏度和特異性比芯片更好，因此在待分析miRNA數(shù)量不多時(shí)是。多重定量PCR圖譜分析的準(zhǔn)確性可用更加靈敏的單重分析來驗(yàn)證。

Peng Jin（埃默里大學(xué)）

我們一般采用miRNA TaqMan分析來確定特定miRNA的表達(dá)。我們嘗試了多種方法，發(fā)現(xiàn)TaqMan的靈敏度和特異性更好。當(dāng)然，在小RNA的數(shù)字表達(dá)譜上，我們也使用高通量測序，它與TaqMan分析有著很好的相關(guān)性。

Winston Kuo（哈佛大學(xué)）

我們已經(jīng)使用過多種miRNA圖譜分析技術(shù)，包括Exiqon、Febit、High Throughput Genomics、Invitrogen和Luminex。Exiqon的microRNA芯片平臺含有LNA寡核苷酸捕獲探針。LNA是核苷衍生物，它提高了雙鏈分子的解鏈溫度。這大大改善了雙鏈分子的熱穩(wěn)定性和特異性。LNA核苷的摻入還能實(shí)現(xiàn)捕獲探針的Tm均一化。這對芯片的性能非常重要，因?yàn)閙iRNA很短，Tm差異大。Luminex的FlexmiR microRNA panel結(jié)合了Exiqon的LNA探針來實(shí)現(xiàn)高特異性。HTG則采用了互補(bǔ)的核酸酶保護(hù)探針與樣品中的miRNA雜交，然后進(jìn)行S1核酸酶反應(yīng)來破壞錯(cuò)配的探針，非常靈敏。

Joshua Mendell（約翰霍普金斯大學(xué)）

在我們實(shí)驗(yàn)室，我們正在采用定制的芯片，主要因?yàn)樗?jīng)濟(jì)且易用。對于更高的靈敏度，也有好的選擇，如Exiqon和Agilent的芯片及Applied Biosystems的TaqMan array。

Silvia Monticelli（瑞士生物醫(yī)學(xué)研究所）

在多年的northern雜交和點(diǎn)雜交后，我們越來越多地使用Applied Biosystems的miRNA TaqMan分析，它非常特異和靈敏，而且數(shù)據(jù)總是與northern blot很好地關(guān)聯(lián)。

Q2：你如何驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果？

Galina Gabriely（哈佛大學(xué)）

我們使用TaqMan microRNA assay的定量RT-PCR，并用其它穩(wěn)定表達(dá)的miRNA來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。你也可以使用snoRNA來標(biāo)準(zhǔn)化。不管怎樣，我們一般使用兩個(gè)或三個(gè)不同分子來標(biāo)準(zhǔn)化，以確?？煽康仡A(yù)計(jì)miRNA的量。同時(shí)，為了確保結(jié)果可重復(fù)，我們會重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

Peng Jin（埃默里大學(xué)）

通過早期不同分析形式的比較，我們發(fā)現(xiàn)miRNA TaqMan分析是非?？煽康?。對于高豐度的miRNA，我們也用傳統(tǒng)的northern blot來驗(yàn)證表達(dá)數(shù)據(jù)。

Winston Kuo（哈佛大學(xué)）

我們利用三種互補(bǔ)的策略驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果：
1. qPCR：我們使用過兩種方法，miScript SYBR Green System（Qiagen）和TaqMan miRNA assays（ABI）。我們傾向于前者，因?yàn)樗衟oly-A加尾方法，回避了內(nèi)源3’端miRNA序列多樣性的問題。這種多樣性是TaqMan莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物策略的問題。從技術(shù)的角度，單個(gè)oligo dT的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Qiagen）在費(fèi)用、移液操作和可變性方面優(yōu)于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄。我們在384孔板上開展qPCR分析，每個(gè)處理組有四個(gè)樣品和三次實(shí)驗(yàn)重復(fù)（總共12個(gè)孔），以獲得可靠、重復(fù)性好的結(jié)果。同時(shí)還包括無模板、無引物的對照。

2. Northern blotting：我們使用放射性標(biāo)記的LNA寡核苷酸作為探針，進(jìn)行miRNA的northern blot。許多miRNA在功能相關(guān)家族中發(fā)現(xiàn)，這些家族成員的種子序列為100%同源，只有3’端變化。因此，在使用qPCR或northern時(shí)，你必須驗(yàn)證分析只檢測目的miRNA，而不是其它成員。我們在玉米（Zea）RNA載體背景中加入合成的成熟miRNA（IDT）來驗(yàn)證。

就northern來說，每個(gè)miRNA家族成員的合成miRNA在含有8M尿素的15% PAGE膠上進(jìn)行。優(yōu)化雜交溫度，讓LNA探針只與目的miRNA結(jié)合，而不與其它成員結(jié)合。一旦利用加標(biāo)策略建立了適當(dāng)?shù)膎orthern雜交條件，就能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)樣品。

3. 原位雜交：我們也利用Exiqon的DIG標(biāo)記的miRCURY LNA microRNA檢測探針，來確認(rèn)我們的miRNA表達(dá)結(jié)果和組織特異性。

Joshua Mendell（約翰霍普金斯大學(xué)）

無論使用哪個(gè)平臺，小心驗(yàn)證所有的芯片結(jié)果是很重要的。我們一般使用northern blotting（當(dāng)我們有較多RNA時(shí)），或者實(shí)時(shí)定量PCR（當(dāng)RNA比較珍貴時(shí)）。我們發(fā)現(xiàn)只有操作正確，兩種方法都能產(chǎn)生高質(zhì)量的表達(dá)數(shù)據(jù)。Northern blotting比較便宜，但需要很多RNA，而定量PCR更靈敏，也更貴。