qPCR常見問題及解決方案

對于從事分子生物學(xué)研究的實驗猿來說，RT-qPCR實驗可謂是老生常談了?？此骑L(fēng)平浪靜，只需“RNA提取-反轉(zhuǎn)錄-熒光定量”這些按部就班的操作，實則險象環(huán)生，一丁點的出錯都有可能讓我們懷疑人生。

即便如此，在CNS的召喚下我們?nèi)耘f一遍遍的重復(fù)、重復(fù)、再重復(fù)。小翊深有體會，為此嘔心瀝血整理出來常用的SYBR Green染料法RT-qPCR實驗的幾個常見問題，并給出了可能的原因和解決方案，希望大家能夠順利度過RT-qPCR大關(guān)。

 RT-qPCR實驗中，大家或多或少會遇到擴增曲線異常、熔解曲線異常和重復(fù)性不好的問題，可從以下幾個方面對癥分析。

擴增曲線異常

正常的擴增曲線一般呈S型，Ct值在20-30之間。異常的擴增曲線包括曲線無平臺期、曲線呈鋸齒狀和Ct值偏大等現(xiàn)象。

1. Ct值偏大（如Ct值＞30）

1）模板量低或基因表達豐度低，建議增加模板量觀察Ct值能否成相應(yīng)倍數(shù)減少。

2）qPCR整個反應(yīng)條件不適宜或引物設(shè)計不當導(dǎo)致擴增效率低，建議通過標準曲線確認擴增效率。

3）擴增產(chǎn)物過長，建議用三步法程序擴增或通過優(yōu)化引物，擴增產(chǎn)物長度不超過300bp。

4）體系中可能存在抑制劑影響酶的活性，建議梯度稀釋模板或重新制備純度更高的模板。

2. 擴增曲線無法達到平臺期

基因豐度低、循環(huán)數(shù)較少，建議增加循環(huán)數(shù)或選擇適合低豐度基因定量的產(chǎn)品。

3.擴增曲線平臺期鋸齒狀

1）RNA純度低，建議梯度加大模板稀釋倍數(shù)看優(yōu)化效果或重新制備高純度RNA重新實驗。

2）儀器長時間未校準，建議定期進行儀器校準保養(yǎng)。

4.有熔解曲線，無擴增曲線

可能是擴增程序設(shè)置錯誤，未進行熒光信號搜集，建議重新實驗，增加擴增程序中延伸階段熒光信號的搜集。

5. 陰性對照有擴增

1）NTC有擴增，可能有以下兩種情況：

①Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃（一般正常qPCR產(chǎn)物，大小在100-300bp之間，熔解曲線Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚體導(dǎo)致，可進一步優(yōu)化引物。

②有Ct值且＜35，表示反應(yīng)體系被污染，可逐步排除污染源。

2）NRC有擴增

NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有g(shù)DNA污染。建議用DNase I消化或使用含有g(shù)DNA去除的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

【注】NTC是指將H₂O代替模板的陰性對照反應(yīng)；NRC是指將未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板的陰性對照反應(yīng)。

6.復(fù)孔重復(fù)性差

1）加樣誤差導(dǎo)致，建議移液器定期校準，另外可通過擴大反應(yīng)體系或提前配制好預(yù)混液優(yōu)化。

2）模板量低，建議提高模板量，使Ct值落在15-30之間。

3）儀器長時間未校準，建議定期進行儀器校準保養(yǎng)。

熔解曲線異常

熔解曲線常用來判斷qPCR結(jié)果的特異性，理想的熔解曲線為單峰，異常的熔解曲線會出現(xiàn)雜峰、雙峰、寬峰等可能的情況，下面我們來逐一分析。

1.熔解曲線出現(xiàn)雙峰

1）雙峰，較低峰Tm在80℃之前

可能存在引物二聚體,建議降低引物濃度或重新設(shè)計引物等方式優(yōu)化。

2）雙峰，雙峰Tm在80℃以后

①引物特異性過差導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增，建議Blast檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。

②gDNA污染，可通過NRC進行確認。若NRC有Ct值，可重新制備模板。

2. 熔解曲線單峰但不尖銳

可能存在大小相近的非特異性產(chǎn)物，建議進行高分辨率瓊脂糖電泳確認。

3.熔解曲線單峰但Tm值在80℃以前

推測未加模板，僅有引物二聚體的擴增。進行高分辨率瓊脂糖電泳確認產(chǎn)物或重復(fù)實驗。

4.有擴增曲線，無熔解曲線

可能是熔解程序設(shè)置錯誤，未搜集熒光信號，建議重新實驗，增加熔解曲線階段的信號搜集。

5.熔解曲線峰型雜亂

1）反應(yīng)體系污染，結(jié)合NTC和NRC結(jié)果確認污染情況，建議從水，引物，酶和環(huán)境等逐一排除污染。

2）試劑暴露在強光或高溫下導(dǎo)致試劑失效，建議用新的試劑做對比實驗。

3）儀器長時間未校準，建議定期進行儀器校準保養(yǎng)。

4）耗材與儀器不匹配，需確認對應(yīng)儀器對耗材的要求。

6.兩種試劑對比，得到的Tm值不一樣

可能是不同試劑的促解鏈成分或含量不一樣，導(dǎo)致解鏈溫度Tm值不一樣。

以上就是小翊為大家整理的RT-qPCR實驗中可能遇到的問題及相應(yīng)的建議，希望對大家有所幫助