用途 禽流感病毒 N9 亞型（AIV-N9）反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測試劑盒，用于檢測 禽組織、分泌物、排泄物及尿囊液中的 AIV-N9，適用于 AIV-N9 的診斷、檢測和流行病學調(diào)查。 原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點

合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延 伸的循環(huán)，使特異 DNA 段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35 次循環(huán)，終使擴增 DNA 段放大了數(shù) 百萬倍。將擴增 DNA 段進行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA 段的擴增帶。

試劑盒組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 6 個月。

需自備的物品

1．儀器：分析天平、離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、 微波爐、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。 2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL 一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL 量筒、500 mL 錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌 1.5mL 離心管和吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、 滅菌雙蒸水。

注意事項

1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室。

2．PCR  整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴 增區(qū)→電泳區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。

3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃。

4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時間。

5． 染色液低毒，操作時應(yīng)戴上手套，避光保存，較長時間不使用請存放于 4℃，以免揮發(fā)變干。

染色液和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。

6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

7．嚴格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須。

8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。

樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、肌肉和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或 排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復(fù) 凍融。）

2  樣品處理：每份樣品分別處理。

2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.02 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2  陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。

2.3  陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。

操作步驟

1 病毒 RNA 的提取

1.1 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～

5 min。

1.2  將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時 堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。

1.3  棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。

1.4 重復(fù)步驟 1.3。

1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。

1.6  將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm

離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。

2 RT-PCR 擴增

每份總體積 20 µL，含 16.8 µL RT-PCR 反應(yīng)液（用前混勻），1.2 µL 酶混合液，2 µL 模板 RNA。 例如：n 份樣品，配制 n+1 份，16.8×（n+1）RT-PCR 反應(yīng)液，再加入 1.2×（n+1）酶混合液，

混勻后取 18 µL 分裝成 n 份，分別加入 2 µL 模板 RNA（陽性對照管加入 1 µL 陽性對照 RNA 和 1 µL X 液），加入礦物油 20 µL 覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴增儀不用加礦物油），作好標記。

在 PCR 擴增儀上進行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；循環(huán) 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃

30 s，共 35 次；再 72 ℃延伸 7min。

3 電泳

稱 3 g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍 TAE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL），于微波爐中熔解，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳 槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR 擴增產(chǎn)物 10 µL，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以 110～ 120V 電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

結(jié)果判定 陽性對照出現(xiàn) 377bp 擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。 被檢樣品出現(xiàn) 377bp 擴增帶為禽流感病毒 N9 亞型陽性，否則為陰性。