如何完成一次又經(jīng)濟(jì)的Tunel檢測(cè)？

——Yeasen TUNEL detection Kit 讓“美”原位呈現(xiàn)

通過(guò)TdT轉(zhuǎn)移酶將Fluorescein-dUTP結(jié)合到有缺口的DNA上是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用方法之一，如Roche提供的In Situ Cell Death Kit正是基于這個(gè)原理。產(chǎn)品中的TdT轉(zhuǎn)移酶活性直接影響到標(biāo)記的效率。翊圣生物立足于酶制劑生產(chǎn)，力求開(kāi)發(fā)以酶制劑為基礎(chǔ)的產(chǎn)品，推出三款熒光素（Alexa Fluor 640，Alexa Fluor 488，FITC）標(biāo)記的Tunel檢測(cè)試劑，在滿足客戶對(duì)產(chǎn)品高品質(zhì)要求的同時(shí)又可以享受低至Roche一半的價(jià)格。

目前已經(jīng)有超過(guò)120個(gè)課題組正在使用該產(chǎn)品，并在雜志上發(fā)表多篇英文文章，如Theranostics和EMBO Molecular Medicine等。

檢測(cè)機(jī)理：

細(xì)胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移（TdT）的作用下，將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3-末端，從而可通過(guò)檢測(cè)熒光完成對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL），原理見(jiàn)圖1。

圖1：脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）原理圖

產(chǎn)品特點(diǎn):

適用范圍廣：可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞。

檢測(cè)靈敏度高：可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞。

背景干擾?。?/span>信噪比高。

觀察多樣性：熒光顯微鏡觀察，流式檢測(cè)。

數(shù)據(jù)展示：

1、小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L）Tunel檢測(cè)

圖2：小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L凋亡檢測(cè)。行代表陰性對(duì)照，第二行代表陽(yáng)性對(duì)照。

檢測(cè)試劑：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

2、石蠟切片樣本的Tunel檢測(cè)

圖3：在皮下移植瘤模型中，單獨(dú)使用LY3009120或聯(lián)合使用Vemurafenib和Obatoclax可以有效延緩甲狀腺癌[5]。IF=8.8

樣本類型：石蠟包埋的腫瘤組織（取自裸鼠）。檢測(cè)試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

3、細(xì)胞爬片的Tunel檢測(cè)

圖4：硫酸鋅對(duì)不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響^[11] 

樣本類型：HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）。檢測(cè)試劑：Cat No. 40308 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 640)

4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖5：PA處理可以有效降低重編程（reprogramming）過(guò)程中凋亡的發(fā)生^[9]。IF=3.7

樣本類型：iPS Cells。檢測(cè)試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

文獻(xiàn)引用：

[1] Li C, Wang Q, Gu X, et al. Porous Se@ SiO2 nanocomposite promotes migration and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cell to accelerate bone fracture healing in a rat model[J]. International Journal of Nanomedicine, 2019, 14: 3845. (IF 4.76)

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[11] Li G, Yin Q, Ji H, et al. A study on screening and antitumor effect of CD55-specific ligand peptide in cervical cancer cells[J]. Drug Design, Development and Therapy, 2018, 12: 3899.(IF 3.27)

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常見(jiàn)問(wèn)題：

Q:出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記？

1）組織/細(xì)胞本身核酶或聚合酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記，例如平滑肌細(xì)胞。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽(yáng)性。

2）使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?，例如一些酸性固定液，?dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性。建議采用新鮮配置的4%中性對(duì)聚甲醛固定液。

3）TUNEL檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TUNEL檢測(cè)反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。

Q:熒光背景很高？

1）高速分裂和增殖的細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄水平高，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。

2）在激發(fā)光下長(zhǎng)時(shí)間的暴露，導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

Q:標(biāo)記效率低？

1）使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。

2）固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。

3）組織切片過(guò)厚，使得固定效果不理想，控制在10 μm以內(nèi)。

4）熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10min就會(huì)嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。

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