| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 蜱傳腦炎病毒(Tick-borne Encephalitis Virus,TBEV)是一種RNA病毒,由蜱傳播,在春夏季節(jié)流行于俄羅斯及我國東北森林地帶,非疫區(qū)易感人被帶有病毒的蜱叮咬后,易感染發(fā)病,另外因喝生羊奶(羊感染時奶中有病毒或被蜱類污染)而被傳染,約經(jīng)8~14天潛伏期后發(fā)生腦炎,出現(xiàn)肌肉麻痹、萎縮、昏迷致死,少數(shù)*者也常肌肉麻痹。居住在森林疫區(qū)的發(fā)生腦炎,出現(xiàn)肌肉麻痹、萎縮、昏迷致死,少數(shù)*者也常肌肉麻痹,因此快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn): 1. 一站式,用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,包括引物和對照。 2. 根據(jù)蜱傳腦炎病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,具有良好的特異性。 3. 基于染料法qRT-PCR檢測,靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。 4. 使用一管式qRT-PCR技術(shù),RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。 5. 本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于臨床。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 規(guī)格及成分 |
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| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供RNA段作為陽性對照。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 自備試劑 | 樣品RNA | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 使用方法 | 一、稀釋陽性對照(以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。 1. 標(biāo)記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。 2. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。 3. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。 4. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 二、樣品RNA的制備 5. 如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號(濃度為1×10E4拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對照。 6. 用自選方法純化N+2個樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈送20次免RNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝 三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行) 7. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+4個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),1個用于PCR陽性對照(用第4號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把6個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個,其余不變。 8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加):
注:需使用ROX染料I的機(jī)型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。 需使用ROX染料II的機(jī)型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用ROX的機(jī)型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。 9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR(參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化)。
四、數(shù)據(jù)處理 10. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,再推算出其濃度。 11. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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