實驗方法原理

1. 從動物或人組織中提取的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中，細(xì)胞會有不同程度的分裂增殖，稱為增殖性衰老 。但是有些細(xì)胞在自發(fā)或其他條件誘導(dǎo)下可突破增殖性衰老，擁有無限增殖的能力，成為永生化細(xì)胞，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，可作為組織工程種子細(xì)胞的來源。

2. 端粒酶對染色體的穩(wěn)定性及決定細(xì)胞生命周期起極其重要的作用。端粒酶或末端轉(zhuǎn)移酶是由兩個主要的亞單位構(gòu)成：RNA成分（hTR）和蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT），RNA（hTR）亞單位普遍表達于正常和腫瘤組織中，而蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT）僅在腫瘤細(xì)胞、生殖譜系細(xì)胞及激活的淋巴細(xì)胞中表達。

3.  細(xì)胞衰老機制現(xiàn)在管遍接受的是細(xì)胞衰老兩階段模型-M1/M2模型，細(xì)胞在生長過程中，經(jīng)過多次分裂后，在腫瘤抑制因于p53和pRb等作用下，細(xì)胞對生長因子的反應(yīng)消失，出先有絲分裂反應(yīng)的消失，DNA合成抑制蛋白的產(chǎn)生。DNA合成停止，細(xì)胞不可逆的停滯于G1期，發(fā)生衰老（sesence. M期），細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡，永生化指的是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞自發(fā)的或受外界影響從增殖衰老中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。

實驗材料 人間充質(zhì)干細(xì)胞

試劑、試劑盒 葡萄糖 L-谷酰胺胎牛血清青霉素鏈霉素聚凝胺

儀器、耗材 培養(yǎng)瓶多孔板

實驗步驟

材料 

無菌

生長培養(yǎng)基：含高濃度葡萄糖（4.5 g/L）的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培養(yǎng)液（DMEM），添加 L-谷酰胺 2 mmol/L、10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 ug/mL 鏈霉素

聚凝胺： 8 mg/mL

普通容器 ：培養(yǎng)瓶 25 cm2，75 cm2

反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的產(chǎn)生用材料 

細(xì)胞系:

PG13

GP+E-86

反轉(zhuǎn)錄病毒載體 GCsam hTERT

轉(zhuǎn)染用 htrt DNA

Tx 緩沖液 ：總量 20 mL，含有以下物質(zhì)：

HEPES 0.5mol/L，pH 7.1   200uL

NaCl，5rnol/L   100uL

Na2 HPO4/NaH2PO4，1mol/L   3uL

UPW   1.7 mL

緩沖液 A：總量 20.04 mL，含有以下物質(zhì)：

NaCl（5mol/L）   600uL

EDTA（0.5mol/L）40uL

Tris-HCl，pH7.5（0.5mol/L）400uL

UPW   19 mL

hMSC（人間充質(zhì)干細(xì)胞）細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)用材料 

hMSC（人間充質(zhì)干細(xì)胞）細(xì)胞

培養(yǎng)瓶 75 cm2

多孔板 6 孔

轉(zhuǎn)導(dǎo)后用材料 

用于冷凍保存的實驗材料（見方案 20.1）

用于 DNA 指紋分析 (見方案 16.8) 或 DNA 圖譜分析（見方案 16.9）或其他驗證分析方法的實驗材料（如方案 16.10）

CR 試劑 

DNA 100 ug/mL

10x PCR 緩沖液 L（含 Mg2+）

正向引物（2umol/L）

反義引物（2umol/L）

dNTP 混合物（10 mmol/L）

DNA 聚合酶

UPW

操作步驟 

反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的產(chǎn)生 

具有 hTERT 基因的反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體通過兩個步驟包裝進入長臂猿白血病病毒（GALV）包裝的細(xì)胞系 PG13。首先，使用 20 ug/mL htrtDNA（Geron）轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系 GP+E-86，然后用上清液感染 PG13 細(xì)胞。

1. 6.7x105 GP+E-86 細(xì)胞系接種在一個小培養(yǎng)瓶（25 cm2）中。

2.GP+E-86 細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染

（a）將 280uL Tx 緩沖液加人每個管中（常用容器）。

（b）制備 DNA 管：

組成名稱    DNA 濃度   15 ug DNA      緩沖液 A       CaCl2 2.5mol/L     總量

                       Z*ug/uL       X*uL            280-30-X                  30                280

* X x Z = 15 ug

（c）將 Tx 緩沖液逐滴加人含有 DNA 溶液的管內(nèi)，輕輕地混合。

（d）在室溫下孵育 30℃，使其產(chǎn)生沉淀。

（e）在每個含有 GP-E-86 細(xì)胞的 25 cm2 培養(yǎng)瓶中，加入 5 mL 新鮮培養(yǎng)液。

（f）輕輕加入混合液（Tx+DNA）至 GP+E-86 細(xì)胞，在 37℃ 孵育 4-6 h。

（g）在 25 cm2 培養(yǎng)瓶內(nèi)，用 D-PBSA 小心地洗三次。

（h）加新鮮培養(yǎng)液至細(xì)胞中，在 37℃ 孵育過夜

3. 更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加 2 mL 新鮮培養(yǎng)液 (取代以前 5 mL 培養(yǎng)液)，以產(chǎn)生病毒。

4. 在進行第三步的同一天，將 1x104個 PG13 細(xì)胞接種于 6 孔板的每個孔中。

5. 次日，從感染的 GP-E-86 細(xì)胞收獲其上清液，加入終濃度為 8 ug/mL 的多聚胺 (如 1 ug/mL 上清液)。

6. 用孔徑 0.45 um 濾膜過濾上清液，將 2 mL 過濾液加至含 GP-E-86 細(xì)胞的每個孔中。

7. 在 32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板。

8. 在 37℃ 孵育過夜。

9. 次日，更換細(xì)胞的培養(yǎng)液。

hMSC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo) 

1. 將 2x106 PG13 細(xì)胞種人 75 cm2 培養(yǎng)瓶中。

2. 次日，將 6 mL 新鮮培養(yǎng)液加至 PG13 細(xì)胞中。

3. 第三日，將 hMSC 細(xì)胞（約 2.5x104~7.5x104 個）加至 6 孔板中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)。

4. 從包裝的細(xì)胞收獲上清液，加入終濃度為 8 ug/mL 的多聚胺，用孔徑 0.45 um 的濾膜過濾上清液。

5. 將 2 mL 過濾后的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液加入 6 孔板的每個孔中。

6. 在 32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板，37℃ 孵育過夜。

7. 吸去逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)物的處理 

1. 經(jīng)過 10~12 次傳代接種，未接受 hTERT 基因的細(xì)胞將死亡，剩余的細(xì)胞 則肯定已插入 hTERT 基因，具有 hTERT 基因的細(xì)胞將在傳代過程中被選擇出來。

2. 建議將細(xì)胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的貯備庫，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞處于不同的群體倍增（PI）水平（可與 PD 生長曲線相匹配）。這樣做也可節(jié)省時間，因為如果發(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細(xì)胞，重新開始。

3. 在梅次傳代培養(yǎng)時，用下列公式獲得 PD，以建立 PD 生長曲線。

公式中的 PD 代表種群倍增的次數(shù)，In 是自然對數(shù) Nstart 是細(xì)胞初始接種量，Nfinish 是細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中所獲得的全部細(xì)胞數(shù)。

例 1，如果初種入 2x105個細(xì)胞，培養(yǎng)后增加至 3.2x106個細(xì)胞，則：

如果按 1:4 的細(xì)胞量進行傳代培養(yǎng)，則每次傳代培養(yǎng)后的 Nfinish 將乘以 4。所以在上述例子中，假設(shè)有 10 次傳代培養(yǎng)，Nfinish 就是（3.2x106）x4 的 10 倍，也就是 3.4x1012。

例 2，如果初種入 2x105 個細(xì)胞，培養(yǎng)后可增加至 3.2x106個細(xì)胞。以 1:4 的細(xì)胞址傳代培養(yǎng) 10 次，則：

4. 在建立永生細(xì)胞系之后，必須檢查其真實性，以確保其來源于初的材料， 而不是由于交叉污染從實驗室其他永生細(xì)胞系衍生而來（見 19.5 節(jié)）。這是能做到的，例如針對轉(zhuǎn)移基因（hTERT）（見下）的 PCR 檢測、DNA 指紋檢 測（見方案 16. 8）或 DNA 圖譜檢測（見方案 16.9）。

hTERT 的 PCR

1. 溶解 PCR 試劑并保存在冰塊中 

2. 對下列試劑進行仔細(xì)的混合，記住，一定要包括陽性對照（其他 hTERT 陽 性標(biāo)本）和陰性對照（無 DNA 模板）

DNA1uL（100ng）   100 ug/mL

10xPCR 緩沖液（含Mg2+）   2uL

正義引物   2uL

反義引物   2uL

dNTP 混合物（10 mmol/L）   0.4uL

DNA 多聚酶   0.1uL

UPW   12.5uL

終體積為 20 mL（包括 DNA）

3. 將管子置于 PCR 儀器中，按以下步驟進行操作：90℃，3 min，首先進行變性作用；94℃，30s，再次進行變性作用；59℃，39s，進行復(fù)性；74 ℃，1 min，進行延伸；如此循環(huán) 30 個周期，然后是 74℃，1 min。

4. 將 PCR 產(chǎn)物在 1.5%~2% 瓊脂糖凝膠中進行電泳。

收起 

注意事項

將細(xì)胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的貯備庫，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞處于不同的群體倍增（PI）水平（可與 PD 生長曲線相匹配）。這樣做也可節(jié)省時間，因為如果發(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細(xì)胞，重新開始。    

在建立永生細(xì)胞系之后，必須檢查其真實性，以確保其來源于初的材料， 而不是由于交叉污染從實驗室其他永生細(xì)胞系衍生而來。

其他

參考轉(zhuǎn)導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化的研究