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羊邊界病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

來源:上海雅吉生物科技有限公司   2019年09月18日 09:08  

 

產(chǎn)品及特點(diǎn)

羊邊界病病毒(Border Disease Virus,BDV)會(huì)引起羊邊界病,是新生羔羊以身體多毛生長不良和神經(jīng)異常為主要特征的一種先天性傳染病。邊界病病毒的臨診表現(xiàn)主要取決于宿主的年齡。臨診疾病限于在懷孕期受到感染的新生或年幼羔羊。如一個(gè)羊群受到感染時(shí),主要表現(xiàn)在繁殖季節(jié)不孕或流產(chǎn)增多,流產(chǎn)可發(fā)生于懷孕的任何時(shí)期,但以懷孕后90天左右為多。由于胎兒的嚴(yán)重畸型導(dǎo)致脊柱后側(cè)凸或關(guān)節(jié)變曲而表現(xiàn)為難產(chǎn)。邊界病病毒呈世界性分布,大多數(shù)飼養(yǎng)綿羊國家都有本病的報(bào)道,因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn):

  • 一站式,用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,包括引物和對(duì)照。
  • 根據(jù)羊邊界病病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,具有良好的特異性。
  • 基于染料法qRT-PCR檢測,靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
  • 使用一管式qRT-PCR技術(shù)RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
  • 產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于臨床。

 

規(guī)格及成分

成  份

編號(hào)

十孔包裝

2×qRT-PCR 緩沖液

190101a

500 μL(棕色管)

10×qRT-PCR酶混合液

190101b

100 μL(紅蓋)

 ROX染料I

190101c

50 μL(棕色管)

ROX染料II

190101d

50 μL(棕色管)

熒光PCR模板稀釋液

180701

1mL(亮黃蓋)

羊邊界病病毒RT-PCR引物混合液

14-43600yw

100 μL(白蓋)

羊邊界病病毒RT-PCR陽性對(duì)照

(1×10E8拷貝/μL

14-43600pc

50 μL(黃蓋)

天凈沙核酸釋放劑試用裝

61202

20次(1mL,綠蓋)

使用手冊(cè)

14-43600sc

1份

 

 

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為12個(gè)月。陽性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供DN段作為陽性對(duì)照。

 

自備試劑

樣品RNA

 

使用方法

一、稀釋陽性對(duì)照(以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。

  • 標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)
  • 7號(hào)管中加入5 μL 10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照(本試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
  • 換槍頭,在6號(hào)管中加入5 μL 10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
  • 換槍頭,在5號(hào)管中加入5 μL 10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

  • 如果有N個(gè)樣品,必須設(shè)置N+2個(gè)提取,多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽性對(duì)照)一個(gè)是NC樣品制備陰性對(duì)照)。可以用10μL上步制備陽性對(duì)照梯度稀釋液中的4號(hào)濃度為1×10E4拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)??梢?/span>用水作為制備的陰性對(duì)照。
  • 用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)20次免RNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝

三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行

  • 如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照,6個(gè)用標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照(用水做模板),1個(gè)用于PCR性對(duì)照(用第4號(hào)陽性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè),其余不變。
  • 標(biāo)記管中下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋子后后加):

成分

N+2個(gè)制備所得樣品

RT-PCR陰性對(duì)照

RT-PCR陽性

對(duì)照(2-7管)

2×qRT-PCR 緩沖液

10μL

10μL

各10μL

口蹄疫RT-PCR

引物混合物

2μL

2μL

2μL

50×ROX (見注)

0.4μL

0.4μL

各0.4μL

 樣品制備所得RNA模板(來于8

5.6μL

不加

不加

稀釋所得6個(gè)陽性對(duì)照(來于第6步)

不加

不加

5.6μL(2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管

10×qRT-PCR

酶混合液

2μL

2μL

2μL

注:需使用ROX染料I的機(jī)型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的機(jī)型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000

需要使用ROX的機(jī)型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

  • 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR(參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化)。

過程

溫度

時(shí)間

RT逆轉(zhuǎn)錄

50℃

15-30分鐘

預(yù)變性

94℃

2分鐘

RT - PCR反應(yīng)

30個(gè)循環(huán))

95℃

15 秒

60

15 秒(采集FAM通道的熒光信號(hào)

72

15 秒

儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析

  • 數(shù)據(jù)處理
  • 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,推算出其濃度。
  • 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。

 

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

羊邊界病病毒可視化RT-LAMP檢測試劑盒

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