產(chǎn)品及特點(diǎn) 牛細(xì)小病毒(Bovine Parvovirus,BPV) 會引發(fā)牛細(xì)小病毒感染,是一種接觸性傳染病,以下痢為主要癥狀,其特征是母牛生殖機(jī)能障礙,導(dǎo)致妊娠母牛感染導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎,犢牛感染則表現(xiàn)腸炎、腹瀉。牛細(xì)小病毒感染在牛群中發(fā)生比較廣泛,目前國內(nèi)外對其研究的較少,發(fā)生此病的國家也不多,本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測牛細(xì)小病毒的試劑盒,它具有下列特點(diǎn):
1.即開即用,用戶只需要提供樣品DNA模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高。
3.提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高,引物是根據(jù)牛細(xì)小病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會跟其他病毒的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分 成分 編號 十孔盒包裝
2×Probe qPCR MagicMix 190303 0.5 mL(本色蓋)
熒光PCR模板稀釋液 180701 1 mL(黃蓋)
牛細(xì)小病毒 PCR引物 15-44000yw 100 μL(白蓋)
牛細(xì)小病毒 qPCR探針 15-44000pro 100 μL(棕色管)
牛細(xì)小病毒陽性對照2.0
(1×10E8拷貝/μL) 15-44000pc 50 μL(紅蓋)
天凈沙核酸釋釋劑試用裝 61202 50次(2.5mL)
使用手冊 15-44000sc 1份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為12個月。
自備試劑 樣品DNA。
使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1.標(biāo)記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。
3.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.如果有N個樣品,設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。
8.用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送50次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝,該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板,省略了DNA提取步驟。
三、Probe qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)
9.如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加):
成分 樣品管
N+2個 PCR陰性對照管 標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品管(2-7管)
2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各10 μL
牛細(xì)小病毒 qPCR探針 2 μL 2 μL 各2 μL
牛細(xì)小病毒 PCR引物混合液 2 μL 2 μL 各2 μL
待測樣品DNA模板 6 μL 不加 不加
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液(2-7號) 不加 不加 各6μL(2號樣到2號管,3號樣到3號管…)
11.蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行PCR:
過程 溫度 時間
預(yù)變性 94℃ 5 min
PCR反應(yīng)
(40個循環(huán)) 94℃ 0.5 min
55℃ 0.5 min(采集FAM通道的熒光信號)
72℃ 0.5 min
后延伸 72℃ 10min
12.如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
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