熒光定量技術(shù)服務(wù) 
 
一、項(xiàng)目簡(jiǎn)介

Real Time PCR法是實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)解析PCR擴(kuò)增量的方法。因其無(wú)需電泳，大大減低了實(shí)驗(yàn)污染的機(jī)率，且具有快速、可對(duì)檢測(cè)靶基因定量而倍受青睞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測(cè)定量產(chǎn)生的偏差，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞、細(xì)菌等mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們?yōu)槟峁┤讓?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及解析服務(wù)：您只需提供組織或細(xì)胞標(biāo)本，我們?yōu)槟瓿蒖NA抽提，cDNA制備，實(shí)時(shí)定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備及數(shù)據(jù)分析的所有步驟。

1、TaqMan探針?lè)椒?br />該技術(shù)以美國(guó) ABI 公司為代表。 PCR 擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線(xiàn)型的寡核苷酸片斷，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，在TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R），如FAM、VIC等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Quencher, Q），如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖4）。所以，每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

2、SYBR Green I嵌合熒光法
SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理：SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖2）。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。

3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。
      SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。

二、服務(wù)項(xiàng)目

1、定性分析
PCR反應(yīng)結(jié)束后的PCR產(chǎn)物無(wú)需電泳檢測(cè)，可以通過(guò)Real Time PCR方法，簡(jiǎn)單快速地對(duì)目的基因進(jìn)行高特異性、高靈敏度的檢測(cè)，同時(shí)閉管操作的實(shí)時(shí)檢測(cè)可以有效防止反應(yīng)產(chǎn)物的污染。本技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于病毒、病原菌等致病微生物的檢測(cè)以及各種生物品種的鑒定等。

2、定量
定量首先必須構(gòu)建與檢測(cè)樣品目的基因具有相同序列的標(biāo)準(zhǔn)品。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作5 個(gè)點(diǎn)以上的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知濃度的檢測(cè)樣品進(jìn)行量（起始拷貝數(shù)）分析。

3、相對(duì)定量（mRNA表達(dá)量分析）
基因表達(dá)的研究一般采用相對(duì)定量的方法。相對(duì)定量法必須對(duì)樣品的目的基因和參比基因內(nèi)標(biāo)同時(shí)分別進(jìn)行定量，然后求出對(duì)于參比基因的目的基因的相對(duì)量。通過(guò)對(duì)樣品間的目的基因的相對(duì)量進(jìn)行比較，可以對(duì)不同樣品間的mRNA進(jìn)行表達(dá)量分析。參比基因通常選用β-actin。通過(guò)同時(shí)對(duì)參比基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)，可以對(duì)樣品之間由于起始細(xì)胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進(jìn)行校正，達(dá)到在嚴(yán)格意義上對(duì)樣品之間的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析之目的。

三、服務(wù)流程

1、客戶(hù)以或郵件形式告知公司要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)基因名稱(chēng)和標(biāo)本數(shù)目；

2、公司派專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員與您洽談實(shí)驗(yàn)費(fèi)用和熒光定量探針設(shè)計(jì)方案（序列和設(shè)計(jì)有公司負(fù)責(zé)）；

3、簽訂實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)合同，交費(fèi)用的50%作為訂金（若實(shí)驗(yàn)沒(méi)有結(jié)果或結(jié)果未達(dá)到客戶(hù)要求，訂金不退）；

4、公司合成熒光定量探針、派相關(guān)人員取回實(shí)驗(yàn)標(biāo)本；

5、進(jìn)行RNA抽提、鑒定、cDNA合成實(shí)驗(yàn)；

6、進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（每個(gè)標(biāo)本的每個(gè)基因均進(jìn)行3倍平行孔實(shí)驗(yàn)，保證獲得準(zhǔn)確、*、客觀(guān)的樣品基因擴(kuò)增數(shù)據(jù)）；

7、通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算目的基因的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)；

8、提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖、分析數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)步驟、試劑儀器）；

9、客戶(hù)交齊全額費(fèi)用。

四、服務(wù)要求

1、請(qǐng)認(rèn)真填寫(xiě)Real Time PCR檢側(cè)技術(shù)服務(wù)委托單；

2、請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料（各種材料的 RNA 提取量請(qǐng)參照“總 RNA 的提取”），或直接提供純化好的總RNA（大于5μg/樣品）；（各種材料的 DNA 提取量請(qǐng)參照“ D NA 的提取”），或直接提供純化好的DNA（大于5μg/樣品） ；

3、如果提供的材料為細(xì)胞或組織，應(yīng)保證材料新鮮：
細(xì)胞樣品：細(xì)胞培養(yǎng)至少達(dá)105以上，培養(yǎng)后細(xì)胞請(qǐng)勿做任何處理。
組織樣品：離體后30分鐘內(nèi)入液氮保存，動(dòng)物組織為5mg以上。
血液樣品：分離白細(xì)胞后，-70℃保存。

4、請(qǐng)通過(guò) 提供已知的全長(zhǎng)基因序列；

5、請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料： DNA/ RNA 來(lái)源、豐度等。

五、  配套服務(wù)項(xiàng)目：
 
1、引物（探針）設(shè)計(jì)和篩選：
根據(jù)您提供的基因序列，我們?yōu)槟峁┮铮ㄌ结槪┑脑O(shè)計(jì)和篩選服務(wù)。

2、基因組DNA提取組織：
新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復(fù)凍融提供樣品量500mg以上，剩下歸還（無(wú)致病性，除脂肪組織、粘液狀組織以外）。
細(xì)胞：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復(fù)凍融提供樣品量105以上。
植物： 提供樣品量500mg以上（新鮮葉片，或4℃保存一周內(nèi)的葉片），剩下歸還（新鮮組織，植物干粉得率較低）。
原核生物：提供樣品量108CFU或者0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝灰陨希ǚ侵虏⌒裕峁┚旰团囵B(yǎng)基信息；致病性，提供滅活菌液等）。

3、基因組RNA提取
組織：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復(fù)凍融提供樣品量500mg以上，剩下歸還（無(wú)致病性，除脂肪組織、粘液狀組織以外）。
細(xì)胞：新鮮樣品或-70℃保存樣品，避免反復(fù)凍融提供樣品量105以上。
植物：提供樣品量500mg以上（要新鮮葉片，或4℃保存一周內(nèi)的葉片），剩下歸還。
原核生物：提供樣品量108CFU或者0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝灰陨稀?

4、質(zhì)粒構(gòu)建：
試驗(yàn)包括：PCR產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化、克隆鑒定和質(zhì)粒提取。

5、RT-PCR反應(yīng)
請(qǐng)您按要求提供試驗(yàn)樣本（詳見(jiàn)基因組DNA提取、基因組RNA提取和反轉(zhuǎn)錄樣品要求）；或提供純化好的DNA樣品5μg。

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