高通量RNA測(cè)序（RNA-seq）有望描繪出轉(zhuǎn)錄組的整體圖像，實(shí)現(xiàn)樣本內(nèi)所有基因及其亞型的完整注釋和定量。隨著測(cè)序價(jià)格的不斷下降，以及個(gè)人化測(cè)序儀的上市，更多的實(shí)驗(yàn)室有機(jī)會(huì)嘗試這種新技術(shù)。

  

        然而，測(cè)序之后的數(shù)據(jù)分析才是真正的挑戰(zhàn)。在RNA-seq之后，還需要一些強(qiáng)大的計(jì)算工具，才能繪制出完整的轉(zhuǎn)錄組圖譜。在這一期的《自然—方法學(xué)》（Nature  Methods）上，來(lái)自MIT和哈佛B(yǎng)road研究院的研究人員發(fā)表了一篇綜述，介紹了轉(zhuǎn)錄組注釋和定量的計(jì)算方法。 

   

        首先，他們介紹了一些方法，將讀數(shù)與參考轉(zhuǎn)錄組或基因組直接比對(duì)。之后，他們討論了鑒定表達(dá)基因和亞型的方法。zui后，他們還介紹了一些方法，來(lái)預(yù)計(jì)基因和亞型的豐度，以及分析樣品間的差異表達(dá)。

  

        由于RNA-seq數(shù)據(jù)生成的不斷改善，現(xiàn)有計(jì)算工具的發(fā)展有著很大差異。在某些領(lǐng)域，如讀數(shù)定位，有多種算法存在，但在差異表達(dá)分析上，解決方案才剛剛出現(xiàn)。作者們強(qiáng)調(diào)了這些方法的核心原理和每種方法的關(guān)鍵差異，以及它們?cè)赗NA-seq分析上的應(yīng)用。他們還討論了這些不同的方法如何影響結(jié)果以及數(shù)據(jù)的闡釋。

  

        為了方便讀者參考，他們還將現(xiàn)有的方法列成了一張表，注明了它們的原理和用途。另外，他們精選了一些有代表性的方法，應(yīng)用在已經(jīng)發(fā)表的RNA-seq數(shù)據(jù)組中。此數(shù)據(jù)組包含了5800萬(wàn)個(gè)末端配對(duì)的讀數(shù)。 

  

        數(shù)據(jù)比對(duì)是RNA-seq分析中的一項(xiàng)基本任務(wù)，然而也面臨著一些挑戰(zhàn)，比如數(shù)據(jù)量大，讀數(shù)很短（36-125  bp），錯(cuò)誤率可觀，且許多讀數(shù)跨越外顯子-外顯子交界。對(duì)于RNA-seq的比對(duì)方法，作者將其分成“unspliced  read  aligners”和“spliced  aligners”  兩類，并分別介紹。

  

         轉(zhuǎn)錄組重建也是個(gè)很困難的任務(wù)，因?yàn)榛虮磉_(dá)差異很大，且讀數(shù)可能來(lái)源于成熟的mRNA，也可能來(lái)源于未*剪接的前體RNA，這樣就很難鑒定成熟的轉(zhuǎn)錄本。當(dāng)然，讀數(shù)短也為分析帶來(lái)了困難。目前的轉(zhuǎn)錄組重建方法主要有兩類，一類是基因組指導(dǎo)的，另一類是不依賴于基因組的。作者比較了這兩類方法，并具體介紹了每一類下面的幾種方法。

  

        至于轉(zhuǎn)錄組的圖譜分析，DNA芯片一直是方法。在使用RNA-seq來(lái)估計(jì)基因表達(dá)時(shí)，需要將讀數(shù)適當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)化，才能提取出有意義的表達(dá)預(yù)測(cè)值。作者介紹了一些方法，來(lái)預(yù)計(jì)基因和亞型的豐度，以及分析樣品間的差異表達(dá)。 

  

        作者還提到，隨著測(cè)序技術(shù)的成熟，如讀長(zhǎng)不斷增加，現(xiàn)有的計(jì)算工具需要發(fā)展，也能滿足新的需求，同時(shí)新工具也會(huì)不斷出現(xiàn)，滿足新的應(yīng)用。（來(lái)源：生物通  薄荷）