阻燃劑TCPP暴露對小鼠的神經毒理作用觀察及相關機制研究

【摘要】目的探討阻燃劑TCPP (tris(2~chloroisopropyl) phosphate)暴露對小鼠的神經毒理作用觀察及相關 機制研究。方法將30只成年KM小鼠隨機分為正常對照組（0 mgKkg，d))、低劑量（TCPP)組（10 mgKkg，d))

和高劑量TCPP組（100 mg^kg*d)),持續(xù)灌胃染毒30 d。染毒結束后，觀察其體質量及一般情況。采用水迷宮實 驗檢測小鼠的學習記憶能力；采用化學發(fā)光免疫分析法測定小鼠血清總三碘甲腺原氨酸（TT3)、游離三碘甲腺原氨 酸（FT3)、總四碘甲腺原氨酸（TT4)和游離四碘甲腺原氨酸（FT4)水平；采用比色法測定小鼠腦組織中谷胱甘肽轉 移酶（GST)和超氣化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)、過氣化氫酶（CAT)水平。結果與對照組小鼠相比,TCPP 高劑量組小鼠飲水量顯著下降（P< 0. 05),肝和脾臟器指數(shù)明顯升高（P< 0. 05)。TCPP暴露組小鼠在水迷宮實驗 中逃避潛伏期均較正常組小鼠出現(xiàn)延長（P< 0. 05),高劑量組小鼠游泳總路程出現(xiàn)明顯升高（P< 0. 05),同時在目 標象限停留時間也明顯縮短（P< 0. 05)。高劑量TCPP染毒組小鼠與對照組小鼠相比TT3、FT3出現(xiàn)明顯增高（P<

0. 05)。與對照組小鼠相比，高劑量TCPP染毒組小鼠GST、OD出現(xiàn)明顯降低，MDA顯著增高（P< 0. 05)。與對照 組小鼠相比,低劑量TCPP染毒組小鼠僅GST出現(xiàn)降低,MDA增高（P< 0.05)。結論TCPP暴露具有明顯的神經 毒性作用，能造成小鼠學習記憶能力喪失，其毒性機制可能與腦組織氣化損傷及甲狀腺激素增高有關。

【關鍵詞】TCPP;學習記憶；甲狀腺激素;氣化損傷;小鼠

有機磷阻燃劑（organophosphate flame retardants, OPFRs)是一種化學性質穩(wěn)定，并能在環(huán) 境中長期存在的新型阻燃劑?？諝?、水體中的 OPFRs會通過呼吸道、消化道進入生物體內¹⁰。隨 著多漠聯(lián)苯釀（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)類阻燃劑的禁用，OPFRs的使用量與日俱 增。有研究顯示，多種環(huán)境介質及生物體內OPFRs 檢出濃度逐年遞增⁰。OPFRs具有多種同系物，其 中磷酸三（2-氯丙基）醋（tris (2~chloroisopropyl) phosphate, TCPP)是目前zui常見的有機磷阻燃劑，而 且在我國環(huán)境中廣泛存在^H。近年來，大量研究證 實OPFRs具有神經毒性、生殖毒性、內分泌干擾效 應、發(fā)育毒性、致癌性^a ,其中以神經毒性及甲狀腺 干擾效應zui為顯著^[4-5。TCPP作為可疑的甲狀腺 激素干擾物（TDCs),可能會對甲狀腺激素產生干擾 效應⁰。甲狀腺激素功能的紊亂，會影響神經及大 腦的發(fā)育。因此，本研究以TCPP為受試物，通過對 KM小鼠灌胃染毒，探索TCPP暴露對KM小鼠學習 記憶能力及其血清甲狀腺激素水平的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物

清潔級4周齡KM小鼠，由桂林醫(yī)學院實驗動 物中心提供SCXK (桂）2013-0001], 60只，雌雄 各半，體質量（26.6 ±4) g。小鼠飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學 院公共衛(wèi)生學院SPF級動物房SYXK (桂）2013- 0001],自由采食和飲水，室內溫度20癈 ~ 25°C,濕 度40% ~ 70%, 12 h亮暗循環(huán)。本研究獲得桂林醫(yī) 學院實驗動物倫理委員會審查批準（GLMC: 201710020)。小鼠的飼養(yǎng)及使用過程嚴格遵守《美 國公共衛(wèi)生署人道管理和使用實驗動物政策》^[7。

KM小鼠在實驗中處于舒適的環(huán)境，并為其提供足 夠的水和食物，舒適的睡眠，按實驗動物使用的3R 原則對其給予人道的關懷。

1.2主要儀器

Morris水迷宮檢測系統(tǒng)，產品型號XR- XM101 (上海欣軟信息科技公司）。

3討論

OPFRs是由磷酸根骨架及三個取代基組成，根 據(jù)取代基的種類，可以分為烷基OPFRs、芳基 OPFRs、鹵代（主要是氯）烷基OPFRs三種。鹵代烷 基OPFRs中又分為TCPP (磷酸三（2-氯丙基）酯）、 冗瓦？（磷酸三氯乙酯）、丁0匸？？（磷酸三（2,3-二氯 丙基）酯）、TDCIPP (磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯）。 TCPP 的化學結構與 TCEP、TDCPP、TDCPP、TDCIPP 相似，均是氯化OPFRs,可以在環(huán)境中長期存在。 TCPP是目前數(shù)量多運用zui廣的氯化OPFRs,可 能對環(huán)境生物和人體帶來巨大危害。目前，大量研 究集中在TCPP對環(huán)境生物的影響。有研究表明, TCPP通過干擾內分泌系統(tǒng)來影響斑馬魚的發(fā) 育^¹。TCPP暴露會導致秀麗線蟲生殖發(fā)育障礙、 運動行為損傷和神經毒性等^M。通過大鼠垂體瘤 細胞（GH3)增殖實驗，發(fā)現(xiàn)TCPP對甲狀腺激素具 有干擾效應⁶³。

然而TCPP對晡乳動物的毒性研究很少。本研 究發(fā)現(xiàn),高劑量TCPP (100 mgKkg*d))灌胃后小鼠 飲水量出現(xiàn)降低，肝和脾臟器指數(shù)出現(xiàn)顯著升高。 這一現(xiàn)象，與其同系物TDCIPP的實驗結果十分相 似。Zhao 等⁶¹² 用 TDCIPP (100 mgKkg.d)、250 mg^kg*d))灌胃青春期雌性大鼠21 d,也出現(xiàn)肝臟 器指數(shù)、（肝、腎臟器指數(shù)）的增加。

TDCIPP(150 mgKkg-d))灌胃大鼠也出現(xiàn)了母鼠 肝質量的增加。這些結果說明，高劑量的TCPP暴 露會對小鼠的生長和發(fā)育帶來不利的影響。但是 皮天星等^M用TCPP對成熟斑馬魚進行染毒，發(fā)現(xiàn) 肝指數(shù)隨著濃度的增加而降低。

TCPP等多種OPFRs(22 ng/g)染毒鳥類21 d,并未 觀察鳥類肝出現(xiàn)氧化損傷，但是肝細胞的完整性和功能性發(fā)生適度的改變。以上結果的不同，可能是 因為實驗動物的種類和劑量、染毒方式的不同所致。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP染毒組小鼠逃避潛 伏期和游行總路程出現(xiàn)明顯延長，在第三象限停留 時間出現(xiàn)下降，說明TCPP暴露后小鼠的學習、記憶 能力出現(xiàn)明顯下降。這一結果說明，TCPP和其他 氯化OPFRs -樣，具有明顯的神經毒性。Tilson 等M用Tcep急性短期（275 mg/kg)灌胃雌性大 鼠，在水迷宮實驗中也出現(xiàn)了學習記憶能力受損。 這些結果與海馬椎體細胞大量減少有著密切的關 聯(lián)。Umezu等^M用TCEP急性短期（200 mg/kg)灌 胃小鼠，小鼠自發(fā)性走動活動增加。這個結果可能 是TCEP拮抗神經遞質₇省基丁酸（GABA)有關。 由于有機磷酸酯類阻燃劑在結構上有與有機磷農 藥類似的磷酸二酯鍵,也有研究認為OPFRs可能通 過抑制膽堿酯酶產生神經毒性⁶¹⁶。但是對線蟲進 行TCEP或TCPP染毒會導致線蟲自主運動缺陷、 帕金森樣運動障礙，引起多巴胺能神經元退化。 TDCIPP對大鼠嗜鉻細胞瘤細胞（PC12)染毒時,導 致細胞內鈣超載，從而激活絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信號通路¹³。上述研究雖然提出了研究 OPFRs的神經毒性機制的新方向，但多為體外或脊 椎動物,還需要進一步在體內和其他物種特別是晡 乳動物中進一步探討。

甲狀腺激素在人類和動物的生理過程中起到 了重要作用，尤其是在中樞神經系統(tǒng)的分化、發(fā)育 及各種功能形成過程中。因此，干擾甲狀腺激素將 會對正常生理功能產生嚴重不良反應。由于TCPP 的化學結構與TT3和TT4結構相似，因此TCPP可 能對甲狀腺素產生干擾效應,故被列為可疑甲狀腺 激素干擾物（TDCs)。流行病學研究顯示，室內粉塵 中TDCIPP的含量與人體血清中FT4有著密切的關 系，二者出現(xiàn)負相關^M。本次研究發(fā)現(xiàn)，高劑量 TCPP染毒組小鼠與對照組小鼠相比TT3、FT3出現(xiàn) 明顯增高。同為氯代有機磷阻燃劑的TDCIPP對大 鼠染毒，也出現(xiàn)了 TT3增高的結論^M。但是 TDCIPP對雞胚、斑馬魚染毒，均出現(xiàn)了 TT4減少的 現(xiàn)象^⁹ — ²⁰,而本研究TT4未出現(xiàn)明顯改變。以上 結論出現(xiàn)不同的原因，可能是因為，相對于其他物 種，晡乳動物具有更好的免疫力和強大的自我調節(jié) 機制。當外界環(huán)境出現(xiàn)改變時，機體內甲狀腺激素 (thyroid hormones, TH)水平會受到干擾。晡乳動物 往往比卵生動物更快的啟動調節(jié)機制，如腦垂體和 下丘腦的負反饋調節(jié)及甲狀腺代償機制來維持甲 狀腺激素的穩(wěn)態(tài)。而且，卵生動物與晡乳動物有著 不同的吸收、分布、代謝、排出的過程。卵生動物免 疫功能及外界環(huán)境抗干擾能力顯著低于晡乳動物, 所以卵生動物比晡乳動物更加敏感。本研究發(fā)現(xiàn)
高劑量染毒導致甲狀腺激素增高，可能是機體的補 償機制。同為阻燃劑的多溴聯(lián)苯醚，也出現(xiàn)了類似 的效應。而且，多個時間點甲狀腺激素的變化水 平，往往比單個時間點甲狀腺激素水平更有意義。 但是，由于本研究經費有限，因此沒有進行多點 檢測。

大腦是機體代謝旺盛的器官，其抗氧化能力 比較弱。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量tcpp暴露均可導致 小鼠腦組織中MDA水平升高（P< 0. 05), GST和 SOD活力下降（P< 0. 05),以及小鼠的學習、記憶能 力出現(xiàn)明顯下降。說明氧化應激在TCPP的神經毒 性中起到重要作用。有研究報道，較高濃度TCPP (100、150、200 pm〇l/L)對人肝癌細胞（HepG2)、人 肺腺癌細胞（A549)、人結腸腺癌細胞（Caco-2)細胞 染毒時，相關細胞活力將受到抑制，其原因是細胞 內產生大量活性氧、誘導DNA損傷及乳酸脫氫酶 (LDH)大量滲出⁰²¹。此外其同系物TDCIPP(30、 60 pm〇l/L)對PC12細胞染毒時，細胞內活性氧增 多,SOD與GSH隨之劑量增高而降低，而MDA呈現(xiàn) 增高的趨勢¹²²。以上研究與本研究結果比較一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP染毒導致小鼠產生 神經毒性及血清中TT3、FT3出現(xiàn)明顯增高。甲狀 腺激素水平的增高，可以介導產生大量活性氧，導 致腦細胞脂質過氧化和腦細胞損傷的發(fā)生，終導 致學習記憶能力下降^M。綜上，TCPP暴露具有明 顯的神經毒性,其毒性機制可能與腦組織氧化損傷 及甲狀腺激素紊亂有關。