ATP酶法冰凍切片人體肌肉組織分型染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

  ATP酶法冰凍切片人體肌肉組織分型染色試劑是一種旨在使用鈣激活技術(shù)，在堿性或酸性條件下，由三磷酸腺苷酶催化水解產(chǎn)生的磷酸與鈣離子結(jié)合，經(jīng)過(guò)氯化鈷的替換，后在硫化銨存在的情況下，呈現(xiàn)組織樣本中酶活性部位的不同深淺棕色沉淀現(xiàn)象的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于人體組織冰凍切片的酶活性檢測(cè)，即人體肌肉組織纖維的分型鑒定。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，靈敏牢固，顯色清晰。

技術(shù)背景

三磷酸腺苷酶或ATP酶（adenosinetriphosphatase；ATPase）可催化ATP水解生成ADP及無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)，這一反應(yīng)放出大量能量，用于運(yùn)送離子進(jìn)出細(xì)胞，同時(shí)供給生物體進(jìn)行需能生命過(guò)程。它存在于生物細(xì)胞的多個(gè)部位，比如肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜上，對(duì)整個(gè)生命的維持有著重要的作用。其中骨骼肌受到神經(jīng)沖動(dòng)的刺激，肌漿內(nèi)鈣離子濃度升高，肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵ATP酶（sarcoplasmic or endoplasmic reticulum calcium ATPases；SERCA）激活，分解ATP釋放能量，肌肉收縮。人類肌肉由兩種纖維構(gòu)成，即I型或紅肌，又稱為慢纖維（slow twitch），和II型或白肌，又稱為（fast twitch）。I型和II型肌纖維混合鑲嵌排列成“棋盤樣（checkerboard）”結(jié)構(gòu)。在身體里，I型和II型纖維的比例取決于肌肉在機(jī)體中的位置和它的功能，相較于II型肌，I型肌的肌球蛋白含量高，線粒體多，毛細(xì)血管密度高，糖原低，適合于有氧呼吸，持久收縮。一般的肌肉，其纖維分布是II型纖維（60至65%）2倍于I型纖維。通過(guò)ATP酶染色，可以顯示兩型肌纖維，輔助診斷神經(jīng)源性肌萎縮、脊髓性肌肉萎縮等。三磷酸腺苷酶（ATP酶）水解三磷酸腺苷為二磷酸腺苷和磷酸，并釋放出能量。磷酸與鈣離子結(jié)合，在酶活性處形成無(wú)色的磷酸鈣，磷酸鈣經(jīng)氯化鈷處理形成磷酸鈷，再經(jīng)硫化銨處理形成棕黑色的硫化鈷沉淀在酶活性部位。

產(chǎn)品內(nèi)容

 堿性液（Reagent A）   毫升

 酸性液（Reagent B）   毫升

 反應(yīng)液（Reagent C）   毫升

 激活液（Reagent D）   毫升

 置換液（Reagent E）   毫升

 清理液（Reagent F）   毫升

 顯色液（Reagent G）   毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書    1份

保存方式

保存 反應(yīng)液（Reagent C）和 顯色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

蘇木素復(fù)染試劑盒（GMS80050）：用于常規(guī)染色后復(fù)染

2毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

小型染色缸：用于染色清洗操作

光學(xué)顯微鏡：用于染色后觀察分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 反應(yīng)液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出200微升到2毫升離心管里，加入xx毫升 堿性液（Reagent A），混勻后，標(biāo)記為 反應(yīng)工作液，置于冰槽里備用（注意：5次操作量）。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣本激活處理

• 取出2片待測(cè)的5至10微米厚的冰凍組織切片，標(biāo)記為1和2（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)3和4）
• 小心加上xx微升 堿性液（Reagent A）在1號(hào)切片上，鋪滿整個(gè)樣品表面
• 室溫下孵育2分鐘
• 同時(shí)小心加上xx微升 酸性液（Reagent B）在2號(hào)切片上，鋪滿整個(gè)樣品表面
• 室溫下孵育2分鐘
• 小心移去2號(hào)切片上的 酸性液（Reagent B）
• 室溫下，小心將2號(hào)切片置入xx毫升 清理液（Reagent F）中孵育1分鐘,，期間輕輕攪拌
• 小心移去1號(hào)切片上的 堿性液（Reagent A）和2號(hào)切片上的 清理液（Reagent F）
• 分別加上xx微升 反應(yīng)工作液，鋪滿整個(gè)樣品表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘
• 小心移去 反應(yīng)工作液
• 小心加上xx微升 激活液（Reagent D），鋪滿整個(gè)樣品表面
• 室溫下孵育3分鐘
• 小心移去  激活液（Reagent D）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12至14二次

二、樣本染色處理

• 小心加上xx微升 置換液（Reagent E），鋪滿整個(gè)樣品表面
• 室溫下孵育3分鐘
• 小心移去 置換液（Reagent E）
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升 清理液（Reagent F）中孵育2分鐘,，期間輕輕攪拌
• 小心移去切片上的 清理液（Reagent F）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟4和5一次（注意：清洗不干凈，可見(jiàn)棕黑色殘?jiān)w粒）
• 小心加上xx微升 顯色液（Reagent G），鋪滿整個(gè)樣品表面
• 室溫下孵育2分鐘；或持續(xù)孵育直至可見(jiàn)淺棕和深棕色為止
• 小心移去 顯色液（Reagent G）
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升 清理液（Reagent F）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的 清理液（Reagent F）

• （選擇步驟）樣本復(fù)染處理

• 樣本復(fù)染處理（蘇木素）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須帶手套
• 建議使用異戊烷（isopentane）快速冷凍組織，避免切片冰晶形成
• 冰凍切片不宜固定和包埋處理
• 試劑溶液在樣品表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿樣品表面
• 組織細(xì)胞染色注意不要過(guò)度
• 可以使用有機(jī)溶劑（乙醇、二甲苯等）脫水、透明處理后封片 
• 組織細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，否則會(huì)逐漸褪色 
• ATP酶染色參考圖像：

1）1號(hào)切片

2）2號(hào)切片

• 本公司提供系列特定組織染色試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰