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qPCR實(shí)驗(yàn)的Ct值的合理范圍--Ct值過(guò)大或過(guò)小的解決方法
理性闡述qPCR實(shí)驗(yàn)的Ct值的合理范圍。（附Ct值過(guò)大或過(guò)小的解決方法）
Ct值是什么？
Ct值具有什么樣的作用？
Ct值的正常范圍是多少？
Ct值太大或者太小的原因？
Ct值是熒光定量PCRzui重要的結(jié)果呈現(xiàn)形式。它被用于計(jì)算基因表達(dá)量差異或者基因拷貝數(shù)。那么熒光定量的Ct值多大可被認(rèn)為是合理？如何保證Ct值的有效范圍呢？今天就讓小編來(lái)為大家解答這個(gè)問(wèn)題。
Ct值是什么？
qPCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)的所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。簡(jiǎn)單講，Ct值就是qPCR中起始模板擴(kuò)增達(dá)到一定產(chǎn)物量時(shí)，所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。所謂“一定產(chǎn)物量”后續(xù)作進(jìn)一步解釋。
Ct值有什么作用？
1.指數(shù)擴(kuò)增、模板量與Ct值的關(guān)系
理想情況下，qPCR中的基因經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)數(shù)被指數(shù)擴(kuò)增而積累，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)。然而qPCR反應(yīng)并不是一直處于理想情況下，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到“一定產(chǎn)物量”時(shí)，此時(shí)循環(huán)個(gè)數(shù)為Ct值，處于指數(shù)擴(kuò)增時(shí)期。Ct值與起始模板量的關(guān)系：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。起始模板量濃度越高，Ct值越?。黄鹗寄０辶繚舛仍降?，Ct值越大。
2.擴(kuò)增曲線、熒光閾值與一定產(chǎn)物量
qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物量是以熒光信號(hào)的形式直接呈現(xiàn)，也就是擴(kuò)增曲線。在PCR早期，擴(kuò)增處于理想情況下，循環(huán)數(shù)較少，產(chǎn)物積累少，產(chǎn)生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生增加進(jìn)入指數(shù)期。可以在PCR反應(yīng)剛處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，以此作為“一定產(chǎn)物量”，并且由此來(lái)推斷模板zui初的含量。因此，一定產(chǎn)物量對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，也就是熒光閾值。
在PCR的后期，擴(kuò)增曲線不再呈現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，進(jìn)入線性期和平臺(tái)期。
3.Ct值的重現(xiàn)性
PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
Ct值的范圍？
1.擴(kuò)增效率En
PCR擴(kuò)增效率是指聚合酶把待擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)變生成擴(kuò)增子的效率。由1個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)變生成2個(gè)DNA分子時(shí)的擴(kuò)增效率為100%。擴(kuò)增效率常用En表示。為了方便后續(xù)文章的分析，簡(jiǎn)要介紹下影響擴(kuò)增效率的因素。
影響因素 | 解釋 | 如何判定？ |
A.PCR抑制劑 | 1.模板RNA中可能含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)或去污劑等。 2.反轉(zhuǎn)錄后的cDNA中含有高濃度的模板RNA和反轉(zhuǎn)錄試劑成分，也可能對(duì)后續(xù)PCR存在抑制。 | 1.可通過(guò)測(cè)定A260/A280和A260/A230比值或RNA電泳，判斷是否存在污染。 2.反轉(zhuǎn)錄后cDNA是否按照一定比例進(jìn)行稀釋。 |
B.引物設(shè)計(jì)不合理 | 引物不能有效退火 | 檢查引物是否存在二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)、存在錯(cuò)配；有時(shí)需注意跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)。 |
C.反應(yīng)程序不合適 | 1.引物不能有效退火。 2.DNA聚合酶活性未充分釋放， 3.長(zhǎng)期高溫，DNA聚合酶活性下降。 | 1.退火溫度高于引物Tm值。 2.預(yù)變性時(shí)間太短。 3.反應(yīng)程序各階段時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。 |
D.試劑未充分混勻或移液誤差 | 反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)成分的局部濃度過(guò)高或不均勻，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增不呈指數(shù)擴(kuò)增。 |
|
E.擴(kuò)增子長(zhǎng)度 | 擴(kuò)增子長(zhǎng)度太長(zhǎng)，超過(guò)300bp，擴(kuò)增效率低。 | 檢查擴(kuò)增子長(zhǎng)度是否在80bp-300bp之間。 |
F.qPCR試劑的影響 | 試劑中DNA聚合酶濃度較低或Buffer中離子濃度非*化，導(dǎo)致Taq酶活力未達(dá)zui強(qiáng)。 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定引物擴(kuò)增效率。 |
2.Ct值的范圍
Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認(rèn)為擴(kuò)增在基線期范圍內(nèi)，未達(dá)到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，也就是標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率為100%時(shí)，計(jì)算出基因單個(gè)拷貝數(shù)定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數(shù)小于1，可認(rèn)為無(wú)意義。
對(duì)于不同的基因Ct范圍，因起始模板量中基因拷貝數(shù)和擴(kuò)增效率不同，需做出該基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出基因的線性檢測(cè)范圍。
3.Ct值的影響因素
由擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En會(huì)對(duì)Ct值產(chǎn)生影響。模板質(zhì)量或者擴(kuò)增效率的差異會(huì)造成Ct值偏大或過(guò)小。
4.Ct值過(guò)大或過(guò)小
小翊威逼利誘了我公司技術(shù)部的大佬們，總結(jié)出Ct值常見(jiàn)的兩類問(wèn)題的原因和解決方法，以饗讀者。
問(wèn)題 | 可能的原因 | 解決方法 |
Ct值過(guò)大 | 1.模板濃度低或存在PCR抑制物 2.擴(kuò)增效率低 | 1.提高模板濃度；或提高RNA或cDNA稀釋比例；或重新制備模板。 2.降低退火溫度，或選用二步法擴(kuò)增；組分和體系充分混勻；優(yōu)化反應(yīng)程序；或嘗試更換試劑。 |
Ct值過(guò)小 | 1.模板濃度高 2.NTC和NRC存在污染 3.引物設(shè)計(jì)不合適 | 1.減少模板RNA量；或更高比例稀釋cDNA。 2.重新更換所有試劑；或使用UDGase防污染試劑。 3.優(yōu)化程序，避免非特性擴(kuò)增。 |
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