細(xì)胞血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

  細(xì)胞血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)三肽化合物底物FAPGG，在血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶1抑制劑的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的水解，釋放出FAP，產(chǎn)生吸收峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等）血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）的特異活性檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，具有高通量、自動(dòng)化操作的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)背景

血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I-converting enzyme；ACE；EC3.4.15.1），又稱(chēng)為肽基二肽酶A（peptidyl dipeptidase A）、羧基組織蛋白酶（carboxycathepsin）或激肽酶II（kininase II），是一種體細(xì)胞類(lèi)150至180KD、生殖細(xì)胞類(lèi)90至110KD的多肽外切酶（exopeptidase）和鋅金屬肽酶（zinc metallopeptidase）。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶有2種同工酶：1型和2型，其間80至90%同源。I型主要存在于肺毛細(xì)管細(xì)胞內(nèi)，也在血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和睪丸leydig細(xì)胞膜中表達(dá)；II型主要存在于心臟和腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上。ACE在腎素-血管緊張素-醛固酮（aldosterone）系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。作為血管收縮劑（vasoconstrictor），ACE催化十肽血管緊張素I的C末端的組胺酰亮氨酸（histidylleucine）二肽的切離水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為血管緊張素II；同時(shí)作為血管擴(kuò)張劑（vasodilator），ACE使緩激肽（bradykinin）失活。ACE常用于藥物靶標(biāo)，治療高血壓（例如噻嗪化物thiazide）、心力衰竭（例如利尿靈furosemide）、糖尿病腎病和SARS等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物呋喃基丙烯酰苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycylglycine；FAPGG），在血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶1抑制劑甲羥孕酮醋酸酯（Foroxymithine）的存在下，受到血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的水解，釋放出呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（furylacryloylphenylalanine；FAP）和雙甘氨肽（glycylglycine），產(chǎn)生吸收峰值的變化，在分光光度儀（340nm 波長(zhǎng)）下，來(lái)定量測(cè)定血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2的特異活性。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2反應(yīng)系統(tǒng)為：

ACE2

FAPGG   →  Furylacryloylphenylalanine  +  glycylglycine

    Foroxymithine

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A） 120毫升

  裂解液（Reagent B）  15毫升

  緩沖液（Reagent C）   5毫升

  陰性液（Reagent D）     1毫升

  底物液（Reagent E）     1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶(hù)自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

超速離心管：用于樣品離心的容器

臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

4℃超速離心機(jī)：用于分離膜蛋白成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

超聲儀：用于裂解樣品

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或200微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測(cè)定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品制備

• 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）
• 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的500微升  裂解液（Reagent B） 
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下） 
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的超速離心管，轉(zhuǎn)至步驟18
• 加入200微升  裂解液（Reagent B），混勻沉淀顆粒
• 超聲處理：200瓦，50%功率，5秒一次，間隔3分鐘，重復(fù)2次——此步驟獲得粗提總蛋白
• （選擇步驟）放進(jìn)上述超速離心管到4℃超速離心機(jī)離心30分鐘，速度為40000g
• （選擇步驟）小心移出上清液到到預(yù)冷的1.5毫升離心管——此步驟獲得膜蛋白
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好藥物處理的待測(cè)樣品
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘），并置零或0分鐘和30分鐘各測(cè)讀1次，并置零
• 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照

• 活性測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取180微升  緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入50微升  底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育15分鐘
• 分別加入20微升  陰性液（Reagent D）或上述制備的待測(cè)樣品（100微克總蛋白或50微克膜蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板（限定在10秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)37℃預(yù)熱的酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到200微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)
• 獲得吸光讀數(shù)：0分鐘讀數(shù)－30分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

• 酶標(biāo)儀檢測(cè)

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 0.758（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾FAP/分鐘

• 比色皿檢測(cè)

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 0.758（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾FAP/分鐘

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 樣品避免使用EDTA和EGTA等處理
• 加樣后10秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定持續(xù)30分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣品0分鐘讀數(shù)通常和背景空對(duì)照0分鐘讀數(shù)一致，約為1.5左右
• 樣本測(cè)定30分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)，即讀數(shù)下降，表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本為總蛋白，其濃度為100微克/20微升；待測(cè)樣本為膜蛋白，其濃度為50微克/20微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2抑制劑DX600（IC50=10微摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• 血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶2單位活性定義為：在37℃，pH 8.3條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1微摩爾呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（Furylacryloylphenylalanine）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感