經(jīng)過一系列處理后,變?yōu)橐子谖胀庠碊NA的狀態(tài),稱為感覺態(tài)細胞。
表面正電荷增加,膜和壁的通透性增加,能夠非選擇性的吸附并攝取外源DNA。
同時,由于感受態(tài)細胞結(jié)構(gòu)不完整,敏感性增加,過于激烈的操作會使其破裂,因此操作時應(yīng)注意動作輕柔。
感覺態(tài)細胞在基因工程實驗中,經(jīng)常要使用各種細胞進行DNA的轉(zhuǎn)化操作。轉(zhuǎn)化指同源、異源的“裸露”的DNA分子被細胞攝取并得到表達的基因水平轉(zhuǎn)移過程。制備是分子生物學(xué)研究中的一個重要環(huán)節(jié),其制備質(zhì)量的好壞直接影響到后續(xù)實驗工作的進行。
注意事項:
1.制作時應(yīng)使用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷這些玻璃器皿或塑料容器時應(yīng)盡量洗凈。由于微量的洗滌劑或污染物都可能降低細胞的轉(zhuǎn)化效率,因此在洗刷完用于制作細胞的玻璃器皿或塑料容器后,用去離子水浸泡一晚,然后再充分洗凈。
2.制作時使用的菌種,不應(yīng)使用4℃或常溫保存的傳代細菌。應(yīng)使用-70℃保存的菌種,在LB抗生素平板培養(yǎng)基上分級劃線培養(yǎng)后,挑取單菌落。使用這種菌種制作的感覺態(tài)細胞,能提高轉(zhuǎn)化效率。
3.菌體的濃度是影響感受態(tài)效率高低的主要因素,適于本法的菌體濃度應(yīng)在OD600值0.05-0.11之間。
4.用于制備的菌體培養(yǎng)停止后要立即處理,不要將培養(yǎng)液過長時間室溫放置,在冰中放置時也不要時間過長。
5.制備操作過程中,離心后棄上清時要盡量棄盡,否則會降低轉(zhuǎn)化效率。
6.主要的轉(zhuǎn)化操作都是無菌操作,并且在冰上進行。
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