做多了IHC實驗的小伙伴，相信對于抗原修復都不陌生，這看似簡單的一小步，往往會對IHC實驗產(chǎn)生顯著影響。愛必信作為您身邊的科研百寶箱，秉持著嚴謹認真的態(tài)度，為您總結了一系列從修復緩沖液、煮沸裝置到修復方法，注意事項的小技巧，希望這些小細節(jié)能完善您的實驗，像愛必信一直堅信的一樣，從小處入手，時刻陪伴您的科研生活，助力實驗大成功。

抗原修復是針對石蠟包埋的切片的必要步驟，大多數(shù)甲醛固定的組織在開始染色前都要先修復抗原，這是由于在固定過程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點。常用的兩種方法為熱修復法（HIER）和酶解法。

一、熱修復法

1. 熱修復緩沖液

適用于HIER的緩沖液有多種，我們推薦兩種常用的緩沖液：pH 6.0，10mM檸檬酸鹽緩沖液和pH 8.0，0.5mM EDTA緩沖液。具體使用哪種緩沖液可以參考您的抗體說明書，通常來講，EDTA緩沖液適合多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體，而檸檬酸鹽緩沖液則適用于其他多數(shù)抗體。

愛必信為您提供高品質的熱修復緩沖液：
 

2. 熱修復方法

(1)、高壓蒸汽法

▲ 將合適的抗原修復緩沖液加入高壓鍋內(nèi)，然后將鍋置于加熱板并開至功率，此時不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中，進行脫蠟復水。
▲ 煮沸后，將玻片放入高壓鍋，蓋緊蓋子，小心燙傷。
▲ 高壓鍋達到壓力后，維持3分鐘。
▲ 3分鐘后，關掉加熱板，將高壓鍋取下放置。
▲ 釋放蒸汽，冷水冷卻鍋身。壓力下降后打開鍋蓋，冷水冷卻10分鐘。小心燙傷，修復完畢。

注意事項：

● 3分鐘只是建議時間，并不是所有抗原的修復時間，可以設置對照試驗，分別設定1、2、3、4……分鐘進行探索，確定修復時間。
● 確保玻片*冷卻再進行下一步實驗。

(2)、微波法

微波法不要使用家用微波爐，沒有高壓環(huán)境，修復時間長，會使切片解離。請使用科研微波爐。

向微波爐容器中加入合適的修復緩沖液
▲ 將玻片放入容器，置于微波爐內(nèi)。將溫度設置在98℃維持20分鐘以修復抗原
▲ 20分鐘后，取出容器放置于水中冷卻10分鐘，小心燙傷，修復完畢。

注意事項：

● 要確保修復緩沖液足以浸沒玻片幾厘米，防止煮沸過程中變干。
● 20分鐘同樣也是建議修復時間，可設置對照試驗，自行探究修復時間。
● 確保玻片*冷卻。

二、酶解修復法

可依據(jù)抗體說明書選擇需要的酶，如果沒有，胰蛋白酶適用于大多數(shù)福爾馬林/PFA固定后需要修復的抗原。常使用的酶解修復方法有滴管法和浸泡法。

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(1)、滴管法

▲ 將胰蛋白酶預熱至37℃。小心的將組織切片周圍的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般50-100ul）。用吸管將酶溶液鋪蓋住整個切片，注意不要弄壞組織

▲ 將玻片置于加濕器，然后37℃孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上，否則會因溫度不均影響染色質量?！?盛放玻片的容器先預熱再放入恒溫箱內(nèi)。

▲ 10-20分鐘后，取出玻片，流水沖洗3分鐘。修復完畢。

(2)、浸泡法

將水浴溫度設置為酶適宜溫度。向盛放玻片架的兩個容器中加入超純水。容器放入水浴加熱。
▲ 將玻片放入水浴箱其中一個容器加熱
▲ 用水浴箱中另一個容器中的熱水制備抗原修復緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。
▲ 將加熱過的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈。

注意事項：

有些酶需要特殊緩沖溶液和活性輔助因子。
● 水或緩沖液體積要足夠沒過玻片
● 若將冷玻片直接放入酶溶液中會使溶液溫度降低從而酶活性降低，導致抗原位點修復不*。
● 盡可能快的準備出抗原修復緩沖液以避免妨礙酶活性的發(fā)揮。放入玻片之前使溶液達到需要的溫度。
● 10-20分鐘只是建議孵育實驗?？勺孕性O置對照實驗探究孵育時間。