Western Blot實(shí)驗(yàn)可以說是生物專業(yè)基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)了,WB實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)多問題的,應(yīng)該就是各種背景問題了。為什么明明跑出了想要的趨勢(shì),但就是背景臟?

這里要清楚一點(diǎn)，背景臟不一定是因?yàn)閮x器不干凈造成的,也有可能是蛋白降解或者整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中條件不合適造成的,有可能是以下的環(huán)節(jié)出了問題:

1、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提取蛋白所需的研磨器材,以及制膠的玻璃板、梳子要清洗干凈。

若長(zhǎng)期不使用,建議器材在實(shí)驗(yàn)前再行清洗-次以杜絕相應(yīng)的污染。

2.提取蛋白

選擇臺(tái)適的蛋白裂解液,充分去除一些干擾因素,比如核酸,多糖,脂類等。

建議蛋白在測(cè)量濃度后變性分裝保存，避兔反復(fù)凍融使蛋白發(fā)生降解。

3、制膠

灌膠之前要將配好的試劑充分混勻,灌膠的過程中要掌握好速度,緩慢加入,避兔產(chǎn)生氣泡。

灌注好分離膠后,緩緩加入無水Z醇封膠,該步操作時(shí)速度一定要慢 ,防止膠面被沖變形,在等待分離膠凝固的過程中,不要總?cè)u晃觀察。

溫度較高的情況下, 30min左右就會(huì)凝固,冬天氣溫較低可能需要較長(zhǎng)時(shí)間。

若分離膠液面不平,會(huì)影響后期蛋白電泳的效果。

4.轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜前需在轉(zhuǎn)膜板兩側(cè)各放置3-4張濾紙(兩側(cè)數(shù)量相同) 。

切記不要用手直接接觸PVDF膜和濾紙,手上的油脂會(huì)對(duì)其造成污染,務(wù)必佩戴干凈的手套,全程盡量使用鑷子夾取。

轉(zhuǎn)膜過程中海綿濾紙凝膠-PVDF膜濾紙海綿每-層的氣泡要排空。

轉(zhuǎn)膜時(shí)要使整個(gè)電轉(zhuǎn)儀置于冰水混臺(tái)物中,常用220V或者其他高電壓進(jìn)行。

機(jī)器溫度升高,會(huì)使蛋白降解,也就是轉(zhuǎn)膜后,用麗春紅染色發(fā)現(xiàn)條帶跑糊,發(fā)光后條帶和背景也會(huì)臟的一塌糊涂。

5.孵育抗體

孵育一抗的時(shí)間大多會(huì)選擇4°C過夜,也可以室溫封閉2小時(shí), 4°C過夜效果會(huì)比室溫好, 4°C過夜具體多長(zhǎng)時(shí)間算合適,其實(shí)沒有硬性規(guī)定。二抗孵育的時(shí)間不宜過長(zhǎng), -般是室溫下?lián)u床孵育1~2小時(shí),抗體孵育完成后要清洗干凈,特別是二抗孵育完成后 ,否則可能導(dǎo)致顯影結(jié)果出現(xiàn)高背景。