植物過氧化氫酶（CAT）ELISA酶活試劑盒

本試劑僅供研究使用     

目的：本試劑盒用于測定植物組織勻漿及相關液體樣本中過氧化氫酶（CAT）的活性。

實驗原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被過氧化氫酶（CAT）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的過氧化氫酶（CAT）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品活性.

試劑盒組成：

注：標準品濃度依次為：0、5、10、20、40、80 U/mL.

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。

4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。

5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 

8.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

9.測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

注意事項：

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2.濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3.各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做標準曲線，建議做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔di一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6.底物請避光保存。

7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9.本試劑不同批號組分不得混用。

10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，    

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD      

值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標      

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。                  

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.95以上。

2.批內變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應分別小于10%和15% 。

檢測范圍：                                              

5.0 -80 U/mL

靈敏度：                                              

低檢測濃度小于1.0 U/L

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存： 2-8℃。

2．有效期： 6個月