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熒光定量PCR技術(shù)，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光報告系統(tǒng)，利用熒光信號的變化對PCR過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)對起始模板的定量檢測。
熒光定量PCR屬于精密性試驗(yàn)，需要專業(yè)人員操作，在操作過程中需要注意各方面細(xì)節(jié)實(shí)驗(yàn)以保證實(shí)驗(yàn)的可靠可重復(fù)性。
1、熒光定量PCR操作注意點(diǎn)：
實(shí)驗(yàn)室注意分區(qū)：試劑準(zhǔn)備間，樣本處理間，PCR室，電泳間要有明確區(qū)分，各房間實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)服不得混用；
試劑準(zhǔn)備間及樣本處理間不處理實(shí)驗(yàn)相關(guān)的高濃度的核酸模板（如高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，PCR產(chǎn)物，miRNA的minics等）；
減少頻繁多次的走動，尤其去過電泳間之后當(dāng)天不可進(jìn)入其他房間；
使用生物安全柜加樣，不同位置的移液器不可混用，不要隨意更換其位置；
在檢測體系中添加UNG酶系統(tǒng)用于避免PCR產(chǎn)物的污染。
2、試劑質(zhì)量控制：
對每批次配制或購買的試劑進(jìn)行質(zhì)檢，保證試劑的性能穩(wěn)定可控，均一。
3、試劑使用注意事項(xiàng)：
試劑使用前必須混勻。
4、移液器操作注意事項(xiàng)：
使用結(jié)束后調(diào)整至大量程，取樣時槍頭深入頁面的深度盡量一直保持在1-2mm之間，避免外壁沾過多試劑隨加樣進(jìn)入導(dǎo)致重復(fù)性不好。
5、反應(yīng)液配制及注意事項(xiàng)：
加樣使用合適量程的移液器；對于較小體積的移液，取液時候，不可深入液體太多以免試劑沾到吸頭外壁至移液量不準(zhǔn)確，深入1-2mm即可（尤其是粘稠試劑，如酶，甘油等）；
小體積試劑加樣務(wù)必：取液后眼觀是否取到液體，加樣務(wù)必浸入混合液一下吹吸數(shù)次，棄吸頭前眼觀確定吸頭中無殘留。
6、反應(yīng)液分裝及注意事項(xiàng)：
反應(yīng)液分裝前必須混勻（比如渦旋震蕩或移液器吹吸混勻）再分裝；反應(yīng)液第一個孔分裝必須潤一下槍頭，96孔之間加樣間隔時間盡量保持一致，96孔的點(diǎn)樣位置盡量保持在96孔的相同位置，復(fù)孔之間盡量相鄰點(diǎn)樣，點(diǎn)樣按照一定的順序，吸取時槍頭深入頁面的深度盡量一直保持在1-2mm之間；
加樣使用移液器鑲緊移液器吸頭，每次按至第一檔即可，不可按至第二檔，避免氣泡產(chǎn)生和加樣不準(zhǔn)確（注：這個并不是使加樣準(zhǔn)確的方式，只要保持所有孔的加樣方式相同，可減少加樣誤差；）加樣盡量勻速，不要加樣到孔外面，以免對后面封膜造成影響。
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