摘要：建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中氯霉素濃度的方法。方法采用3通道MRM模式對氯霉素進(jìn)行檢測，一個(gè)通道用于定性，兩個(gè)用于定量。分析方法的定量下限為0.02 ppb，定量線性范圍為0.02 ppb-1.0 ppb，R2 = 0.9980，權(quán)重為1/X。

前言：氯霉素(CAP)是一種廣譜抗生素，早使用于1949年。氯霉素雖然價(jià)格便宜,但因其副作用大，故已不作為治療人類疾病的一線藥物[2,3] 。據(jù)報(bào)道，氯霉素能抑制骨髓細(xì)胞的生長，導(dǎo)致非再生性貧血和可能致命的再生障礙性貧血。此外，氯霉素是一種有效的非競爭性的微粒體酶抑制劑，能影響其它藥物的吸收代謝。氯霉素也可當(dāng)獸藥應(yīng)用,但由于它對人類有許多潛在的副作用，所以在許多國家被限制或禁止使用。歐盟2003/181/EC 決議規(guī)定在牛奶中被檢出任何水平的氯霉素都是不允許的，同時(shí)規(guī)定檢測氯霉素的方法必須符合或優(yōu)于0.3 ppb的低要求 [4] 。

實(shí)驗(yàn)樣品制備氯霉素（CAP），純度98%，購自Sigma-Aldrich；氯霉素-d5 (d5-CAP)，(溶于乙腈，濃度為100 μg/mL)，由劍橋大學(xué)同位素實(shí)驗(yàn)室提供?？瞻着Ｄ袒|(zhì)根據(jù)Cronly等人報(bào)道的方法制得[5] ：在2 mL 的離心管中加 0.5 g 全奶(購買于當(dāng)?shù)爻?和1 mL 乙腈，混合，渦旋30 s；再加入0.25 gNaCl，振蕩30 s, 然后在12000 轉(zhuǎn)速下離心10 min，上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)離心管并置于Eppendorf真空干燥器內(nèi)45 °C干燥。后用0.5 mL的初始流動相（甲醇/水=10/90）復(fù)溶，并用0.2 μm PVDF 過濾針過濾，終得空白牛奶基質(zhì)。不同濃度的氯霉素和0.3 ppb（在基質(zhì)中）的內(nèi)標(biāo)d5-CAP逐個(gè)加入到一定量空白牛奶基質(zhì)中。

色譜條件： • 色譜柱：ACE® C18, 50x2.1 mm, 3 μm • 進(jìn)樣體積：10 μL • 流速：0.5 mL/min • 流動相A：水 • 流動相B：甲醇 • 梯度： • 0.00 min 10% B • 0.05 min 10% B • 2.50 min 95% B • 3.00 min 95% B • 3.10 min 10% B • 4.50 min 10% B 質(zhì)譜條件： • 真空隔層加熱電噴霧源（VIP-HESI）加熱溫度：400 °C • 加熱氣體流量：70 unit • 霧化氣流量：90 unit • 錐孔氣溫度：250 °C • 錐孔氣流量：10 unit • 噴霧電壓：-4500 v • 主動排空: 開 • 標(biāo)準(zhǔn)分辨率 • 轉(zhuǎn)換時(shí)間：100 ms • CAP 和d5-CAP 檢測離子： • m/z 320.9>152 (CE:12 v) 定量 • m/z 320.9>257 (CE: 8 v) 定性 • m/z 320.9>194 (CE:10 v) 定性 • m/z 326>152 (CE:12 v)內(nèi)標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2顯示的是空白牛奶基質(zhì)中加入低濃度0.02 ppb CAP (上樣量為200 fg）的離子流色譜圖。在這色譜圖中可以觀察到有一個(gè)微弱的背景信號干擾。然而，這基質(zhì)干擾峰響應(yīng)值遠(yuǎn)小于低濃度信號強(qiáng)度，0.02 ppb的CAP可以清晰的檢測到。圖3顯示的是0.02 ppb CAP（上樣量為200 fg）在空白牛奶基質(zhì)中三個(gè)選擇離子監(jiān)測離子通道MRM的色譜圖，它們的S/N都大于10。

結(jié)論建立了一種簡單，快速測定牛奶中氯霉素濃度的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法。利用可以對牛奶基質(zhì)中濃度低至 0.02 ppb的氯霉素進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量分析。