靶標(biāo)伴“His”，蛋白純化明明白白！

蛋白純化簡介

蛋白純化是將目標(biāo)蛋白從實(shí)驗(yàn)樣本的總蛋白中分離出來，同時仍保留目的蛋白的生物學(xué)活性及化學(xué)完整性。在構(gòu)建載體階段，除了一些必要的表達(dá)元件，還需要考慮的密碼子優(yōu)化以及標(biāo)簽的選擇。選擇合適的標(biāo)簽不但有利于蛋白的純化，促進(jìn)蛋白的可溶性，同時也不能影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能和下游應(yīng)用。以下簡單列舉幾個常見蛋白標(biāo)簽：

表1 不同蛋白純化標(biāo)簽介紹

濃縮的精華，純化的*

His-Tag 為何會逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品///有效的技術(shù)之一。其主要優(yōu)勢在于：

高序列兼容性：N-端的His-tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容，有利于蛋白表達(dá)；

小序列影響小：His-tag非常小，His-tag對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，不會改變目的蛋白本身的可溶性和生物學(xué)功能；且在融合蛋白結(jié)晶后對蛋白的結(jié)構(gòu)沒有影響；

免疫原性低：His-tag的免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射入動物體內(nèi)進(jìn)行免疫并制備抗體；

聯(lián)合使用性強(qiáng)：與其他的親和標(biāo)簽構(gòu)建成親和標(biāo)簽，并可用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；

適用范圍廣：his標(biāo)簽融合蛋白的適用范圍也較廣，即可用在非離子型表面活性劑存在的條件下純化，也可以在變性條件下進(jìn)行純化。前者通常用來純化疏水性強(qiáng)的目的蛋白，而后者則通常純化包涵體蛋白。

因此，His逐漸成為了蛋白純化的首///選標(biāo)簽。

Yeasen His純化樹脂生產(chǎn)工藝

Yeasen生物自主研發(fā)的HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法偶聯(lián)四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni²⁺）后，形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)可保護(hù)鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，與Ni-IDA樹脂相比，更加穩(wěn)定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室純化His標(biāo)簽蛋白*的樹脂之一

圖1 His樹脂的產(chǎn)品原理圖

產(chǎn)品特性

圖2 His樹脂的產(chǎn)品特性

蛋白純化流程圖

1）裝柱：將HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用裝入合適的純化重力柱中；

2）清洗：3-5倍柱體積去離子水沖洗重力柱；

3）平衡：至少5倍柱體積的Lysis Buffer 平衡含有填料的重力柱；

4）上樣：注意控制加樣速度，耐壓0.1 MPa，流速控制在10滴/min，確保目的蛋白與Ni²⁺充分接觸，以提高純化得率；

5）洗雜，低濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行洗雜；

6）洗脫：使用5-10倍柱料體積Elution Buffer洗脫，收集洗脫液即目的蛋白溶液。

圖2 His 蛋白純化簡易流程圖

HisSep Ni-NTA Agarose Resin測試數(shù)據(jù)

測試產(chǎn)品：

1、某his純化產(chǎn)品；

2、大量生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；

3、小樣生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；

4、本次生產(chǎn)的普通級別的his樹脂（20502ES）；

緩沖液：各個處理組均為1ml樹脂純化200 ml菌液；洗雜使用25mM的咪唑，洗脫液為250mM的咪唑。

測試報(bào)告一：His純化樹脂結(jié)合效率測試，與市場進(jìn)行對比，Yeasen研發(fā)的20502ES  HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4號）具有良好的結(jié)合效率。如下圖：

圖3 His純化樹脂結(jié)合效率測試

測試報(bào)告二：以常利用的變性劑尿素為例，分別進(jìn)行了不同產(chǎn)品在8M尿素下耐受性測試， 20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4號）對尿素的耐受良好，與市場無差異。如下圖：

圖4 His樹脂對8M尿素耐受性測試

測試報(bào)告三：對于20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin（4號）進(jìn)行了批次檢測穩(wěn)定性測試，從結(jié)果看批次間差異基本控制在5%以內(nèi)，以保證更好的穩(wěn)定性。如下圖：

圖5 His純化樹脂的批次間比較

FAQ

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