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重組基因的篩選的方法

來源:上海吉至生化科技有限公司   2020年09月18日 15:45  

不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。

成熟篩選方法如下:

插入失活法

外源DNA、片段插入到位于篩選標(biāo)記基因(抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因)的多克隆位點(diǎn)后,會造成標(biāo)記基因失活,表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變,通過這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍(lán)白篩選法。

PCR篩選和限制酶酶切法

提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板,根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計特異引物,通過PCR技術(shù)篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆,用限制性內(nèi)切酶酶切法進(jìn)一步鑒定插入片段的大小。

核酸分子雜交法

制備目的基因特異的核酸探針,通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。

免疫學(xué)篩選法

獲得目的基因表達(dá)的蛋白抗體,就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達(dá)蛋白抗體,也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達(dá)載體中獲得表達(dá)蛋白的抗體。

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