大腸桿菌

CaCl2 氨芐青霉素 LB

離心機(jī) 分光光度計 搖床

1.  接種一個單菌落于50 ml LB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)過夜（250 r/min）。

2.  往一個2 L 的燒瓶中加入400 ml LB培養(yǎng)液，再加入4  ml 過夜培養(yǎng)液，于37℃；搖床，培養(yǎng)至OD₅₉₀為0.375。

3.  將培養(yǎng)液分裝到8個50 ml 預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 離心7 min。

4.  細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl₂溶液重懸，于4℃，以1 100 g 離心5 min 。

5.  細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl₂溶液重懸，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 離心5 min。

6.  用2 ml  冰冷的CaCl₂溶液重懸各管細(xì)胞，然后按每管250 ul 的量分裝于預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于- 70℃。

7.  按照以下各步驟用10 ng pBR322轉(zhuǎn)化100 ul 感受態(tài)細(xì)菌。

8.  將合適體積的轉(zhuǎn)化物涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

9.  將10 ng 加入到一個15 ml 無菌的圓底試管中，并放置冰上。

10.  將盛有感受態(tài)細(xì)胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

11.  立即將100 ul 感受態(tài)細(xì)菌加 入到管中，輕輕旋動，并放置冰上10 min 。

12.  將管故入42℃水浴2 min 進(jìn)行熱休克，然后加入1 ml LB 培養(yǎng)液于每一支試管中。

13.  于37℃置滾筒式搖床口培養(yǎng)1 h。

14.  將幾個稀釋度菌液涂布于含合適抗生素的平板上，于37℃培養(yǎng)12~16 h。

1.轉(zhuǎn)化菌涂平板前抗生素的量要足夠，涂布細(xì)菌時菌量不要太多，培養(yǎng)時間不要超過16小時。否則抗生素會失效，未轉(zhuǎn)化菌也會生長。

2.制備感受態(tài)細(xì)胞的過程中，每一步操作的動作要輕柔，尤其是懸浮細(xì)胞時要避免用旋禍混合器。

3.所用的CaCl2等試劑均需是高純度的，并用純凈的水配制，好分裝保存于4℃。

4.整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。