核酸檢測(cè)法之核酸隔離采樣工作站

 LB-3315型雙人移動(dòng)式核酸隔離箱

HIV核酸定性檢測(cè)

1.1 方法和試劑

1.1.1 方法

（1）檢測(cè)方法為商品化試劑盒和實(shí)驗(yàn)室自建方法，商品化試劑應(yīng)嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。下面介紹的方法是實(shí)驗(yàn)室自建方法，供參考。

（2）檢測(cè)血漿或血清樣品使用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法，建議輪PCR擴(kuò)增使用RT-PCR一步法；檢測(cè)血細(xì)胞或組織樣品使用PCR方法。一般使用擴(kuò)增兩輪的套式PCR方法。

（3）設(shè)立陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為與待測(cè)樣品同質(zhì)、含有目的基因的樣品；陰性對(duì)照為與待測(cè)樣品同質(zhì)、不含有目的基因的樣品。陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品應(yīng)與待檢樣品處理程序一致。陰性對(duì)照的設(shè)置數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品的數(shù)量設(shè)置在不同的位置。

1.1.2 試劑

（1）PCR引物：一般使用擴(kuò)增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄時(shí)可使用下游特異性引物或隨機(jī)引物。引物設(shè)計(jì)可參考文獻(xiàn)或自行設(shè)計(jì)，應(yīng)盡量涵蓋常見(jiàn)的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。

（2）主要試劑：包括核酸提取純化、逆轉(zhuǎn)錄、PCR所需的試劑。使用商品化核酸提取純化試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)試劑和PCR擴(kuò)增試劑。

（3）抗污染試劑：實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)方法可使用抗污染試劑，參考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。

1.2 擴(kuò)增目的基因片段

1.2.1 樣品的采集和處理

1.2.2 核酸提取