干貨分享|qPCR復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)不同會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？

王老師：您好，近用你們的試劑跑qPCR，復(fù)孔平臺(tái)期的熒光信號(hào)不同，這樣的結(jié)果能用嗎？

小翊：您好，老師。從圖中來(lái)看，復(fù)孔重復(fù)性是比較好的，△Ct值<0.5, 這個(gè)結(jié)果沒(méi)什么問(wèn)題的。

王老師：那為什么復(fù)孔的平臺(tái)期信號(hào)還有相差呢？有什么方法可以使復(fù)孔熒光信號(hào)一致嗎？

近有不少客戶咨詢小翊類似的問(wèn)題，擔(dān)心這樣的數(shù)據(jù)不可靠今天小翊就幫您解除疑慮！

復(fù)孔平臺(tái)期不同不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（△Ct<0.5）

*，理想的PCR擴(kuò)增是使DNA分子由1變2，2變4，以2ⁿ進(jìn)行擴(kuò)增的。但實(shí)際上，隨著循環(huán)數(shù)的增加，體系中的Taq酶、dNTP、引物等逐漸被消耗并伴隨著副產(chǎn)物的生成，使得PCR不能呈指數(shù)擴(kuò)增，從而使實(shí)際的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)“S”型，通常分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期三個(gè)階段，如圖1。

基線期是指PCR開(kāi)始的3-15個(gè)循環(huán)時(shí)期，這段時(shí)期擴(kuò)增是存在的，但因循環(huán)次數(shù)較少，體系中雙鏈DNA積累較少，熒光信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有超過(guò)熒光本底信號(hào)，此時(shí)的熒光值對(duì)于機(jī)器來(lái)說(shuō)很難準(zhǔn)確檢測(cè)。指數(shù)擴(kuò)增期是指PCR產(chǎn)物的量增長(zhǎng)//快的一個(gè)時(shí)期，理想條件下，是呈指數(shù)增長(zhǎng)的，在這個(gè)時(shí)期由于樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，所以復(fù)孔的熒光信號(hào)在這個(gè)時(shí)期相對(duì)一致。通常熒光閾值需要設(shè)置在此時(shí)期，熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱之為Ct值，故各復(fù)孔間的Ct值有較好的重復(fù)性（△Ct＜0.5）。而平臺(tái)期是指由于原料耗盡、反應(yīng)副產(chǎn)物的產(chǎn)生等原因使得擴(kuò)增變得緩慢的一個(gè)時(shí)期。此時(shí)期經(jīng)過(guò)的循環(huán)次數(shù)較多，使樣品間的細(xì)小差異被無(wú)限放大，從而導(dǎo)致復(fù)孔間平臺(tái)期的熒光信號(hào)相差很大。

圖1 擴(kuò)增曲線的三個(gè)階段

下面為大家展示一個(gè)案例，以293T-cDNA的20倍稀釋液為模板，擴(kuò)增GAPDH基因，90個(gè)復(fù)孔（如圖2）。

圖2 同一樣品的90個(gè)重復(fù)的擴(kuò)增曲線圖

由圖可以看出該實(shí)驗(yàn)的復(fù)孔重復(fù)性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE標(biāo)準(zhǔn)。但平臺(tái)期的熒光信號(hào)值均有差異。

綜上：數(shù)據(jù)的有效性和復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)關(guān)系不大，主要與復(fù)孔間的△Ct有關(guān)，MIQE標(biāo)準(zhǔn)是△Ct＜0.5。

在復(fù)孔△Ct<0.5的情況下，復(fù)孔平臺(tái)期不同并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是有沒(méi)有辦法可以讓復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)盡量一致呢？

使復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)趨于一致的秘訣

1、確保加樣的準(zhǔn)確性

1）qPCR各組分*化凍需要混勻。

2）采用預(yù)混的方式進(jìn)行加樣，保證體系的均一性?？梢詫?/span>除模板以外的試劑進(jìn)行預(yù)混，分注至各管中。

3）模板濃度高時(shí)，可將模板稀釋，提高加樣體積，減少加樣誤差。

2、確保移液的精///準(zhǔn)度

加樣過(guò)程需確保移液槍未出現(xiàn)漏氣、漏液的情況，避免使用精///準(zhǔn)度差的移液槍或者不配套的槍頭。

3、體系混勻并進(jìn)行離心

體系加完后要用移液槍吹打并進(jìn)行離心，以防試劑掛壁或者體系中有氣泡造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。

4、qPCR試劑的選擇：選擇“預(yù)混液”形式的qPCR試劑，反應(yīng)體系只需加入引物和模板，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)的操作步驟，減少了加樣誤差。

好了，讀到這里，您應(yīng)該不會(huì)再用糾結(jié)復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)不同的事了吧？為了簡(jiǎn)化您的qPCR實(shí)驗(yàn)操作，讓您的qPCR數(shù)據(jù)更完美，小翊為您推薦一款SYBR Green預(yù)混液：Hieff UNICON^® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat 11184ES），該產(chǎn)品是預(yù)混液形式的qPCR試劑，另外適合于所有的qPCR儀器平臺(tái)（如圖3），兼容快速程序，可以大大簡(jiǎn)化您的實(shí)驗(yàn)操作并能保證您實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。

圖3. 適合于所有的qPCR儀器平臺(tái)