二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）試劑盒說明書

 微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶，既控

制著CO2的固定，同時(shí)又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影

響著光合速率。

測定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）與 1 分子的 CO2結(jié)合，產(chǎn)生 2

分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫

酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的

變化可計(jì)算還原型輔酶 I 氧化速率，還原型輔酶 I 氧化速率可反應(yīng) Rubisco 的活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、

冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 700uL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4

℃保存一周；

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 700uL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4

℃保存一周；

粗酶液制備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL

提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前在試劑二中加入 22.5mL 試劑一，充分混勻，在 37℃（哺乳動(dòng)

物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 6uL 樣本、7uL 試劑三、7uL 試劑四和 180uL 工作

液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)吸光值 A1 和 2min20s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷(V 樣×Cpr) ÷T =2680×ΔA÷Cpr

此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 g 組織 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷(W× V 樣÷V 樣總)

÷T=2680×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4

 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103

L / mol /cm；d：比

色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.006 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；

b.使用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷(V 樣×Cpr) ÷T =5360×ΔA÷Cpr

此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 g 組織 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷(W× V 樣÷V 樣總)

÷T=5360×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4

 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103

L / mol /cm；d：96

孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.006mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；