線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量

試劑盒說(shuō)明書(shū)

 微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

MCA是線粒體三羧酸循環(huán)的一個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，

其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。

配合測(cè)定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 MCA 含量，

其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度，（2）綜合分析丙

酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰

CoA 情況，（3）乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 MCA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)

行狀況。

測(cè)定原理：

MCA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進(jìn)一

步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰，該波長(zhǎng)下吸光

度的變化程度可反映出 MCA 的含量。

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽、蒸

餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

堿性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保

存；

標(biāo)準(zhǔn)液：液體 1mL×1 支，10μmol/mL 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提?。?/span>

稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃

離心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μL 該上清

液和 300μL 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測(cè)定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加

入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重

復(fù) 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測(cè)（不可用于蛋

白質(zhì)含量測(cè)定）。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 330nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min。

3、樣本測(cè)定：

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要各做一個(gè)。

試劑名稱(μL) 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測(cè)定管

試劑一 60 60 60

蒸餾水 60

標(biāo)準(zhǔn)液 60

樣本 60

試劑二 20 20 20

試劑三 60 60 60

充分混勻，330nm 立即測(cè)定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1。

檸檬酸含量計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)

×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測(cè)定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管) ×V

樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，10μmol/mL； V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.06mL；V 樣總：

加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意：檢測(cè)限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。