測(cè)定意義：

ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。

測(cè)定原理：

（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下測(cè)定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。

                             規(guī)格：100管/96樣

乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。

測(cè)定原理：

（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下測(cè)定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 18mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體×1 支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）工作液的配置，將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液，混勻，立即記錄340nm處 20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和3min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

ACK 活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=536×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=536×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=1.072×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1072×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1072×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACK（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=2.144×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。