雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒說明書

 微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定，確保蛋白濃度在 1～

10mg/ml 范圍內(nèi)。

測定意義：

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分

析。

測定原理：

強堿性溶液中，雙縮脲與 CuSO4 形成紫色絡合物；紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成

正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。該方法測定范圍為

1~10mg 蛋白質(zhì)，適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品，尤其是動物材料。

自備儀器和用品：

離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

標準品：液體×1 瓶，5 mg/mL，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取：

1. 液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定。

2. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g

組織，加入 1mL 提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））

冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

3. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建

議 500 萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7

秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取 0.5mL EP 管，加入 40μL 蒸餾水，200μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，

取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，540nm 比色，記為 A 空白管。

3. 標準管：取 0.5mL EP 管，加入 40μL 標準液，200μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，

取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，540 nm 比色，記為 A 標準管。

4. 測定管：取 0.5mL EP 管，加入 40μL 待測液，200μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，

取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，540nm 比色，記為 A 測定管。

注意：空白管和標準管只需測定一次。

樣品中蛋白質(zhì)濃度計算公式：

C 待測（mg/mL）= C 標準管×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

 =5×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

注意事項：

1.樣品蛋白濃度須在 1～10mg/ml 范圍內(nèi)，低于 1mg/ml 不能用此法，高于 10mg/ml 須做相

應稀釋。因此測定前用 1～2 個樣做預實驗，確保蛋白濃度在 1～10mg/ml 范圍內(nèi)。

2.待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。該法受硫酸銨、Tris 緩

沖液干擾，提取液中應不含這些物質(zhì)；否則改用 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。