紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

 微量法 100T/48S

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的酶系，在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物的

代謝，具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相當(dāng)于 CYP2B 亞型，與藥物代謝的去甲基化

密切相關(guān)。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用，也可使

某些藥物經(jīng) CYP2B 代謝活化。

測(cè)定原理：

ERND 催化紅霉素釋放甲醛，通過 Nash 比色測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出 ERND 活性。

自備儀器和用品：

普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔

板、蒸餾水和冰。

試劑組成和配置：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 100mL 蒸餾水溶解。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加 1mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 0.5mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前，加蒸餾水 4.5mL 充分溶解。

試劑六：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑七：液體×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶，-20℃保存。臨用前取 1.5mL EP 管，加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液，加 990μl 蒸餾

水，混勻即為 0.05 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1mL 試劑一，冰上充分研磨，

10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g

離心 30min，棄上清液。

4、終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5mL，充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該

待測(cè)液需當(dāng)天使用。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3. 對(duì)照管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 試劑二，10μL 試劑三，10μL 蒸餾

水，混勻后置于 37℃水浴保溫 30min；立即加入 35μL 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取

出后加入 35μL 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取新的 EP 管，加

入 100μL 上清液，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，

于 412nm 測(cè)定光吸收，記為 A 對(duì)照管。

4. 測(cè)定管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 試劑二，10μL 試劑三，10μL 試劑

四，混勻后置于 37℃水浴保溫 30min；立即加入 35μL 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取

出后加入 35μL 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取新 EP 管，加入

100μL 上清液，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于

412nm 測(cè)定光吸收，記為 A 測(cè)定管。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5mL EP 管，加入 100μL 標(biāo)準(zhǔn)品，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，

然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。

ERND 活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×

稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/g) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍

數(shù)÷（W×V 樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10-4

L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上

清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另

外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣品質(zhì)量，g；V 樣：加入粗酶

液體積，10μL=0.01mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），30min。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×

稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/g) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍

數(shù)÷（W×V 樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10-4

L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上

清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另

外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣品質(zhì)量，g；V 樣：加入粗酶

液體積，10μL=0.01mL； T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），30min。