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許多有機化合物在紫外區(qū)具有特征的吸收光譜，因此可用紫外分光光度計對有機物質進行定性鑒定，結構分析及定量測定。紫外分光光度法定量測定的依據(jù)是比耳定律。首先確定化合物的紫外吸收光譜，確定大吸收波長。在選定的波長下，作出化合物溶液的工作曲線，根據(jù)在相同條件下測得待測液的吸光度值來確定待測液中化合物的含量。
物質的吸收光譜本質上就是物質中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應地發(fā)生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結果。由于各種物質具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結構，其吸收光能量的情況也就不會相同。因此每種物質就有其*的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎。分光光度分析就是根據(jù)物質的吸收光譜研究物質的成分、結構和物質間相互作用的有效手段。
紫外分光光度光度法的定量分析基礎是朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律。即物質在一定濃度的吸光度與它的吸收介質的厚度呈正比。
紫外分光光度計的主要校正內容介紹：
1.吸光度校正
校正吸光度常用一很純物質一定濃度的溶液為標準，且此溶液的吸光度系數(shù)經不同實驗室核對，為了使標準液吸光度不受測定波長的微移動而有改變，常選擇具有較平滑吸收高峰的物質，同時要求溶液穩(wěn)定，且在相當?shù)牟ㄩL范圍內吸收度的改變符合Lambert-Beer定律，常用硫酸銅、硫酸銨鈷和硝酸鈉或鉀的溶液。鉻酸鉀溶液是常用的標準溶液，此溶液在紫外區(qū)和可見區(qū)均適用。
2.波長或波數(shù)校正
可用具有窄吸收帶的溶液，濾光片或蒸氣來校正所需要的光波范圍。如果要求很高的精密度時，可用放電燈泡發(fā)射的射線來校正。有的光譜儀其上已裝有一個為校正用的燈。苯的蒸氣對校正一定范圍的波長亦很有用，可用一小滴苯放于1cm厚的吸收杯中，測其吸收波長，在遠紫外區(qū)可用氧氣的吸收帶進行校正。用各種稀土金屬的濾光片，可以很快地校正波長，但準確度不如上述方法高。常用含有鈥和釹、鐠離子的濾光片。
3.雜散光校正
小量的雜散光往往會引起較大的測量誤差，它的校正可用一個能*吸收某一波長單色光，且在其他波長吸收很弱的溶液。從這個溶液所表現(xiàn)的透光情況可推測雜散光的近似值。由雜散光帶來的偽吸收帶，亦可用Lambert-Beer定律來檢查，但用此定律檢查偽吸收帶誤差較大。由切斷范圍之外所表現(xiàn)的透射比可得出近似的雜散光百分數(shù)。若所含雜散光大于0.1%，應設法減低，或對測得的吸收光度進行校正。由雜散光引起的誤差與雜散輻射成正比，因此校正值很容易從化合物的近于正確的曲線計算而得。此外還可用一個適當?shù)臑V光片，該濾光片在測定波長范圍內*透光，但吸收此范圍外的光波，由此來消除雜散光。
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