【實驗目的】

體外檢測小鼠血清中TNF-α的濃度，了解小鼠攻毒后對TNF-α的變化的影響

【實驗原理】

將酶與試劑抗原用交聯(lián)劑結合起來，此種酶標記抗原與抗本中相應抗體發(fā)生特異反映，并牢固結合，在加入相應的酶的底物時，底物被酶催化生成呈色產物，可根據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。本實驗采用雙抗夾心Elisa法檢測樣本中小鼠TNF-α的濃度

【實驗試劑和器材】

試劑：TNF-α定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

器材：4℃和-20℃冰箱、水浴鍋、恒溫箱、酶標儀、電腦、排槍、移液槍、加樣槽、渦旋振蕩器、槍頭、96孔板

【實驗步驟】

用去離子水將洗滌液稀釋到1倍（用到移液器）；將不同濃度標準品（100ul/孔）加入相應空中（96孔板、移液器），對于血清先加入50ul樣本分析緩沖液后加50ul血清，若稀釋量大，就將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標準品稀釋液補充至100ul，用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育120min（漩渦振蕩器、恒溫箱）；`用1倍洗滌液洗板5次，且后一次至厚吸水紙上拍干；加入生物素化抗體工作液（100ul/孔）。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育60min；洗板5次，且后一次至厚吸水紙上拍干（多孔道手動移液器）；加入酶結合物工作液（100ul/孔）。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫孵育20min；洗板5次，且后一次置厚吸水紙上拍干；加入顯色劑TMB100ul孔，避光室溫孵育20min，加入終止液50ul/孔，混勻后即可測量OD450值（電腦、酶標儀）

【注意事項】

1、ELISA實驗是一個很*確的實驗過程，所以要*確稀釋和加樣

2、恒溫箱中反應時，要嚴格按照上面的時間，不易過長

3、也可用洗板機洗板5次

4、反映終止后要快速測OD值，保證結果的準確性