簡介：抗生素曾被廣泛用于獸藥生產(chǎn)中，用于預防和治 療 疾 病 及 促 生 長 劑等?？股氐臑E用終導致牛奶、肉類等動物源性食品中抗生素殘留量嚴重超標，對人們健康帶來風險。抗生素的殘留會導致毒副反應，例如過敏反應、皮疹和惡心。另外，長期攝入抗生素殘留的食品，會導致抗藥性細菌的傳播。因此，世界各國都實施了動物抗生素使用法規(guī)。例如，歐盟和加拿大制定了食品中藥物高殘留量（MRL），美國將其稱為耐受水平。法規(guī)規(guī)定牛奶中抗生素殘留種類包括磺胺類、β內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯和四環(huán)素。本文中牛奶里各類抗生素的*如表 1 所示。

本文建立了牛奶中抗生素多殘留的LC/MS/MS測定方法?？股胤N類包括環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、青霉素 G、氯唑西林、替米考星、泰樂菌素、紅霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、四環(huán)素和金霉素。以及兩種同位素內(nèi)標為環(huán)丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3。采用改良的 QuEChERS 方法對牛奶中抗生素進行提取。本方法具有良好的線性，高靈敏度、回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性高和特異性強的特點，滿足世界各國監(jiān)管機構規(guī)定的牛奶中抗生素類殘留*的要求。

實驗方法：儀器設備 Perkinelmer Altus ™ UPLC® 液 相 系 統(tǒng)， 含 Altus A-30 溶 劑 管 理 模 塊、 樣 品 管 理 器 和 柱 溫 箱。 質(zhì) 譜 儀： Perkinelmer QSight ™ 210 三重四極桿質(zhì)譜儀。Simplicity 3Q ™軟件平臺控制所有儀器、采集和處理數(shù)據(jù)。方法參數(shù)液相色譜方法以及質(zhì)譜離子源參數(shù)見表 2。溶劑、標準物及樣品前處理所用的溶劑、試劑和稀釋液純度均為 LC/MS 級?？股貥藴饰镔徸?Sigma-Aldrich® 公司，并于 4℃冰箱中保存。除了 β- 內(nèi)酰胺類使用水作為溶劑外，其余抗生素均使用甲醇配制溶液。β- 內(nèi)酰胺類標準溶液需保存于塑料瓶中，其余抗生素類標準溶液可保存在塑料或玻璃瓶中。

從 C18 凈化劑購于 Supelco 公司。所有母液和工作標準溶液均冷藏保存，并使用 2mL 的棕色進樣小瓶，以防止化合物降解。同位素內(nèi)標的使用：環(huán)丙沙星-d8用于氟喹諾酮，磺胺類和四環(huán)素類，氟尼辛-d3用于大環(huán)內(nèi)酯和β-內(nèi)酰胺類。

采用當?shù)厥袌鲑彽糜袡C牛奶作為空白樣品，并對不同脂肪含量的 5 種牛奶樣品進行抗生素殘留檢測。采用簡單改良過 QuEChERS 前處理方法 2,3。具體步驟如下：（1）往 5mL 空白有機牛奶（已添加標準，濃度為 15ng/mL）中加入 20mL 有機溶劑（甲醇或乙腈）；（2）渦旋混勻 1min，置于 7800rpm 下離心 10min；（3）移取上清液，加入 1.2mg 的 C18 凈化劑 ，用于除去脂肪；（4）渦旋 5min，7800rpm 下離心 5 分鐘；（5）提取 12.5mL 上清液，于 40℃用氮氣吹至 1.5- 2mL；（6）用 15% 甲醇水溶液定容至 2.5mL，渦旋混勻；（7）過 0.22µm PVDF 微孔濾膜。本實驗采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析，待上述步驟 7 完成后在進行基質(zhì)配標及添加內(nèi)標，基質(zhì)標準曲線范圍在 0.1ng/ mL-1000ng/mL，每個濃度點重復進樣 5 次，進行精密度實驗。

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化本實驗研究的目標化合物均采用正離子模式的電噴霧模式檢測。采用蠕動泵和液相色譜儀相結合，以三通連接的方式來優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)：如氣體流量、離子源溫度以及離子源的位置。蠕動泵以10µL/min的流速將0.5μg/mL磺胺甲嘧啶注入質(zhì)譜，液相色譜儀以 0.5mL/min 的流速，溶液為乙腈水溶液（V/V， 10/90，含 0.1% 甲酸，5mM 甲酸銨）注入質(zhì)譜中。每個化合物均采用濃度為 0.5μg/mL 來優(yōu)化碰撞能量。Q1 和 Q3 的分辨率為 0.7amu。各個化合的質(zhì)譜參數(shù)詳見表 3，每個化合物均采集 3 對 MRM 離子對，以降低假陽性或假陰性結果。

結果與討論：按照上述確定的實驗方法進行測試，各各個抗生素的校準曲線相關系數(shù)及 LOQ 見表 4。各個抗生素的 LOQ 比法規(guī)中耐受水平還要低至 5-100 倍。實驗結果表明，本方法*牛奶中抗生素的檢測要求。圖 1 為牛奶基質(zhì)加標樣品（濃度為 5ng/mL）中磺胺甲嘧啶的提取離子色譜圖，從圖1可以看出，具有較高的信噪比。采用空白牛奶基質(zhì)作為稀釋液，配制一系列濃度的標準曲線工作液（9 個濃度點），基質(zhì)配標曲線范圍為 0.1-1000ng/mL。圖 2 為磺胺二甲嘧啶校準曲線示例，線性范圍大于 4 個數(shù)量級。所有抗生素化合物的校準曲線線性相關系數(shù) R2 均大于 0.9958，具有良好的線性關系。表 5 為目標化合物在不同濃度下連續(xù)進樣的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。