傳統(tǒng)農(nóng)藥成分分析預(yù)處理方法（QuEChERS方法）是一種在法醫(yī)學(xué)中毒分析的有效的預(yù)處理方法。適用于全血樣品中藥物、毒物提取。

本方法是一種可以提取多種成分穩(wěn)定且可靠的樣品預(yù)處理方法。但傳統(tǒng)QuEChERS方法均為手動(dòng)操作流程，特別樣品量較大時(shí)傳統(tǒng)手工難以應(yīng)對(duì)，需要很長時(shí)間才能完成操作。

本應(yīng)用介紹了以全自動(dòng)方法進(jìn)行QuEChERS萃取流程的案例，以省力、高效和提高樣品預(yù)處理精度為目的，學(xué)會(huì)所發(fā)表了運(yùn)用全自動(dòng)液體萃取平臺(tái)ATLAS-LEXT進(jìn)行全血樣品預(yù)處理方法開發(fā)及方法學(xué)評(píng)價(jià)的相關(guān)內(nèi)容。

實(shí)驗(yàn)方法

? 試劑    

阿普唑侖Alprazolam、溴西泮Bromazepam、溴替唑侖Brotizolam、氯硝西泮Clonazepam、地西泮Diazepam、依替唑侖Etizolam、氟硝西泮Flunitrazepam、氟西泮Flurazepam、尼美西泮Nimetazepam、硝西泮Nitrazepam、奧沙西泮Oxazepam、三唑侖Triazolam和卡馬西平Carbamazepine、奎硫平Quetiapine、唑吡坦Zolpidem，共計(jì)15種（全血樣品中添加濃度為1~200ng/mL）   

? 預(yù)處理    

采用QuEChERS自動(dòng)化方式預(yù)處理供LC/MS分析: ATLAS-LEXT自動(dòng)預(yù)處理流程見圖1。取添加上述藥物的120μL血液樣品的試管A，加去離子水振蕩，稀釋5倍。取含有QuEChERS提取鹽*0.1g和2個(gè)不銹鋼珠的試管B，加乙腈2000μL和內(nèi)標(biāo)溶液20μL，振蕩30秒鐘，向試管B中添加試管A稀釋血液樣品500μL，振蕩3分鐘，在2000×g下離心5分鐘，防乳化傳感器確認(rèn)后取上清液2000μL，轉(zhuǎn)移至試管C中。氮?dú)獯蹈珊蠹蛹状?50μL，振蕩30秒后再溶解，移取至自動(dòng)進(jìn)樣器瓶中待分析。（所需時(shí)間: 30分鐘/樣品）。

圖1 QuEChERS法+ATLAS-LEXT自動(dòng)提取全血中藥物的流程

* QuEChERS鹽試劑：Q-sepTM QuECHERS提取鹽試劑盒MgSO4 6g，NaOAc 1.5g。

QuEChERS法+dSPE純化法的自動(dòng)樣品預(yù)處理（GC/MS用提取法）樣品預(yù)處理流程見圖2。取添加藥物的全血樣品120μL置于試管A中，加去離子水混合，稀釋5倍。取QuEChERS提取鹽*0.1g和2個(gè)不銹鋼珠的試管B，加乙腈2000μL和內(nèi)標(biāo)溶液20μL，振蕩30秒鐘，向試管B添加試管A中血液樣品500μL，振蕩3分鐘，2000×g下離心5分鐘，防乳化傳感器確認(rèn)后取上清液2000μL，轉(zhuǎn)移至含有分散固相提取劑dSPE**0.1g的試管C中，振蕩120秒，2000×g下離心2分鐘。取上清液2000μL，移至試管D中，用氮?dú)獯蹈?。加入甲?50μL，振蕩30秒再溶解，移取并注入自動(dòng)進(jìn)樣瓶。（所需時(shí)間: 40分鐘/樣品）    

圖2 QuEChERS提取法+dSPE純化法在ATLAS-LEXT中自動(dòng)提取全血中藥物的流程

本應(yīng)用還介紹了利用LC/MS進(jìn)行測定的示例，通過改善干固試劑、使用不同的定容試劑或衍生化試劑制備樣品，待分析萃取樣品也可適用于GC/MS分析。    

? 回收率的測定和基質(zhì)效應(yīng)的驗(yàn)證

取用添加濃度為10ng/mL和50ng/mL的血液添加樣品，在ATLAS-LEXT上進(jìn)行自動(dòng)化預(yù)處理，制得待分析樣品溶液，加內(nèi)標(biāo)阿普唑侖-d5，測定各藥物的回收率。血液經(jīng)過提取后采用加標(biāo)萃取樣品溶液計(jì)算獲得的峰面積，并驗(yàn)證基質(zhì)效應(yīng)。

? 定量性及殘留物的驗(yàn)證

在1~200ng/mL的范圍內(nèi)制作每種待測物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)QC試樣中的10ng/mL和50ng/mL樣品同步測試分析，計(jì)算準(zhǔn)確度及精度。連續(xù)對(duì)血藥濃度為200ng/mL的加藥試樣進(jìn)行預(yù)處理，然后測定空白試樣，驗(yàn)證沒有目標(biāo)物殘留。

** 分散固相提取劑 dSPE...Q-sepTM QuECHERS 純化試劑盒MgSO4 150mg，C18 50mg

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與考察

? 回收率和基質(zhì)效應(yīng)的驗(yàn)證

根據(jù)本方法獲得的色譜圖見圖3，每種待測藥物的回收率和基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果見表1。各藥物的回收率總體良好，采用QuEChERS提取法，當(dāng)濃度為10ng/mL時(shí)，回收率≧80%；當(dāng)濃度為50ng/mL時(shí)，回收率≧82%。采用QuEChERS提取+dSPE純化的制備方法時(shí)，在純化時(shí)移液管的操作增多，故回收率低于單獨(dú)提取時(shí)的回收率，但獲得的數(shù)值不妨礙實(shí)際應(yīng)用。此外，當(dāng)濃度為10ng/mL時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)為78~111%；當(dāng)濃度為50ng/mL時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)為95–110%。

圖3、MRM譜圖

? 定量性的驗(yàn)證  

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法繪制每種待測藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，范圍為1~200ng/mL，R2為0.999以上。對(duì)QC試樣進(jìn)行分析，10ng/mL和50ng/mL試樣的分析結(jié)果見表2。在任何濃度下均可以取得良好結(jié)果，且精度在7%以內(nèi)，準(zhǔn)確度在±16%以內(nèi)。

? 殘留物的驗(yàn)證

連續(xù)處理血藥濃度為200ng/mL的高濃度加藥血樣，然后測定空白試樣，結(jié)果顯示，LC-MS/MS未檢出峰，亦未發(fā)現(xiàn)殘留物。

表1 各藥物的回收率和基質(zhì)效應(yīng)

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證（n=5）

總結(jié)

我們?cè)敿?xì)驗(yàn)證了添加溶劑和提取鹽的含量、移液時(shí)的針位的高度等內(nèi)容，開發(fā)出一種盡可能減少提取過程中目標(biāo)物損失的程序。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，其可以自動(dòng)化的執(zhí)行手工預(yù)處理的全部程序。    

1. 使用QuEChERS提取鹽的乙腈提取法（LC/MS用提取法）

2. 使用QuEChERS提取鹽的乙腈提取法+dSPE純化處理的試樣制備法（GC/MS用提取法）

我們?cè)敿?xì)驗(yàn)證了添加溶劑和提取鹽的含量經(jīng)確認(rèn)，2種操作方法都沒有殘留發(fā)生。本法具有穩(wěn)定的操作性、良好的定量重現(xiàn)性，是一種具有*實(shí)用性的自動(dòng)化萃取方法。    

* 參考文獻(xiàn)：日本法中毒學(xué)會(huì)第37屆年會(huì)演講摘要錦集P-12