開(kāi)學(xué)了，過(guò)了一個(gè)寒假，ELISA實(shí)驗(yàn)操作還記得吧，今天恒遠(yuǎn)生物就帶大家一起來(lái)回顧下ELISA實(shí)驗(yàn)的疑難點(diǎn)！

    實(shí)驗(yàn)原理
    ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢

物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

    實(shí)驗(yàn)流程
    夾心法ELISA：

    1.加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個(gè)濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測(cè)樣品加入到其他孔，每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測(cè)范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90分鐘。提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間宜控制在10分鐘內(nèi)。

    2.生物素化抗體/抗原：棄去液體，甩干，不用洗滌。每個(gè)孔中立即加入生物素化抗體/抗原工作液100 μL，混勻，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃孵育1小時(shí)。

    3.洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機(jī)。每一步洗滌充分是實(shí)驗(yàn)的根本。

    4.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。

    5.洗滌：棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，方法同步驟3。

    6.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據(jù)實(shí)際顯色問(wèn)題酌情縮短或延長(zhǎng)孵育時(shí)間，但不可超過(guò)30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止。

    7.終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

    8.讀值：立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置好檢測(cè)程序。

    9.實(shí)驗(yàn)完畢后，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期。

    競(jìng)爭(zhēng)法ELISA：

    1.加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個(gè)濃度的工作液并列加兩孔，每孔50 μL。待測(cè)樣品加入到其他孔，每孔50 μL(若樣本濃度高于檢測(cè)范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。立即每孔加入配好的

生物素化抗體工作液50 μL?；靹?，給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育45分鐘。提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間宜控制在10分鐘內(nèi)。

    2.洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機(jī)。每一步洗滌充分是實(shí)驗(yàn)的根本。

    3.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。

    4.洗滌：棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，方法同步驟2。

    5.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據(jù)實(shí)際顯色酌情縮短或延長(zhǎng)孵育時(shí)間，但不可超過(guò)30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止。

    6.終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

    7.讀值：立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置好檢測(cè)程序。

    8.實(shí)驗(yàn)完畢后，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期。

    恒遠(yuǎn)生物十幾年來(lái)一直致力于生物科研領(lǐng)域，提供全面的、創(chuàng)新的、優(yōu)質(zhì)的、便捷的科研產(chǎn)品和服務(wù)。目前，其自主研發(fā)的重組蛋白、抗體、ELISA檢測(cè)試劑盒得到廣大科研用戶的認(rèn)可，并且多次發(fā)表于期刊，進(jìn)一步推動(dòng)了民族品牌化的傳播。