治療性單克隆抗體結構相對小分子更加復雜。不僅僅是序列影響蛋白活性，同時蛋白的翻譯化修飾也會影響。常見的修飾包括脫酰胺、二硫鍵、末端賴氨酸丟失和糖基化修飾，糖基化修飾是相對復雜的特殊翻譯后修飾，包括N糖修飾和O糖修飾，N糖基化修飾主要發(fā)生在蛋白質一級結構中的特征性序列NXT(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)，修飾存在一定規(guī)律，O糖修飾可以與任何含有羥基基團的氨基酸連接，絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)是常見的修飾位點，因此更加復雜。糖型結構會顯著影響治療效果，是單抗藥物質量監(jiān)測的重要關鍵質量屬性。

抗體生物類似藥在面臨生產和臨床過程中，需要保證質量的一致性，糖基化分析是重要的關鍵分析流程。糖修飾異質性會間接影響藥效，因此需要在多批次生產過程中，保證工藝和質量的穩(wěn)定性。N糖根據不同的連接方式使得N-糖基化的五糖核心結構分為高甘露糖型、雜合型和復雜型3 種類型，F(xiàn)DA，EMA 等生物類似藥指導原則都鼓勵研發(fā)單位采用新的分析技術手段，對生物類似藥和原研藥的糖基化修飾位點、程度以及寡糖的組成進行深入比較分析，例如可以利用島津液相以及質譜等設備可進行由淺入深的糖型修飾分析，進而對產品生產過程中嚴格監(jiān)測。島津在糖基化分析方面有三大護法守護。下面一一道來。

島津抗體糖型分析質控解決方案

第一護法-高分辨質譜

LCMS-9030

LCMS-9030四極桿飛行時間質譜儀使高速度、高靈敏度的四極桿質譜與TOF技術的緊密結合。融合島津先進工程技藝的DNA，打造出速度與出色性能兼?zhèn)涞娜乱淮叻直尜|譜儀，以優(yōu)異表現(xiàn)輕松勝任定性和定量分析挑戰(zhàn)。對完整蛋白以及亞基水平的糖型進行初步分析。

第二護法-MALDI-MS

MALDImini-1

MALDImini-1數字離子阱（DIT）體積極小，功能強大，可實現(xiàn)質譜多級的檢測。針對糖肽分析、抗體化學修飾位點、未知生物分子結構分析，蛋白質、多肽、翻譯后修飾肽等都有專向解決方法。

第三護法-高效液相色譜系統(tǒng)
 

Nexera Bio

從完整蛋白或者亞基水平分析，利用質譜可快速的分析帶有糖基化修飾蛋白分子量?？梢苑治龊唵蔚奶切徒Y構，速度比較快，重現(xiàn)性較好，但是精細的糖型結構也不能很好的監(jiān)測清楚，所以可以搭配糖肽水平和游離寡糖水平一同研究。

首先，第一步從完整蛋白水平，利用島津LCMS-9030四極桿飛行時間質譜儀從完整分子量水平分析抗體的糖修飾情況如下表所示，鑒定并分析相關糖型的分布。

不同糖型抗體形式分子量測定結果與理論對比

第二步可以從糖肽水平分析，通常抗體通過使用蛋白酶酶切后，產生分子量大約為0. 5 ～ 5 kDa 的小肽，采用色譜或電泳分離后再進行MALDI-MS 或ESI-MS 分析。利用質譜分析糖肽序列、寡糖組成，島津MALDI-TOF和MALDI-數字離子阱質譜可以分析相關糖肽組成分析。

例如針對血清糖蛋白，使用MALDI-離子阱質譜分析得到的衍生N-聚糖譜圖，如下圖所示：

血清糖蛋白N-聚糖質譜解析譜圖

第三步可以從游離寡糖層面分析，藥典相關要求，針對游離寡糖的分析通常有三種方法: （第一法）親水相互作用色譜法、（第二法）毛細管電泳法、（第三法）高效陰離子色譜法，通過N-糖苷酶F對單抗N糖進行酶切后，使用2-氨基苯甲酰胺( 2-AB) 或2-氨基苯甲酸( 2-AA) 對寡糖進行標記即可進行糖型分析。針對唾液酸分析，島津超高效液相色譜結合熒光檢測器建立了抗體中唾液酸Neu5Ac 和Neu5Gc 含量測定，結果如下圖所示：

唾液酸液相分析定量標準曲線

單抗糖基化是作為重要的翻譯化修飾，宿主細胞培養(yǎng)工藝過程會影響不同的修飾構成，島津不僅可以提供糖基化質量分析質控方案，同時針對培養(yǎng)工藝優(yōu)化以及工藝殘留物監(jiān)測，提供特色的培養(yǎng)監(jiān)測在線和離線分析解決方案，為了更好地把握產品質量，力圖讓產品質量更加穩(wěn)定和安全。雖然生物類似藥與原研藥批次糖基化修飾結構差異依然存在，但在生物類似藥相似性評價和適應癥外推的征途上還有許多路要走，島津依舊陪伴左右。