細(xì)胞轉(zhuǎn)染 的方法主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法是具有高轉(zhuǎn)染效率、對(duì)細(xì)胞的毒性作用小等。
 

一、脂質(zhì)體(liposome)轉(zhuǎn)染 方法原理

脂質(zhì)體(liposome)轉(zhuǎn)染 方法原理：脂質(zhì)體((Iiposome)作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，用合成的陽(yáng)離子脂類包裹DNA，同樣可以通過(guò)融合而進(jìn)人細(xì)胞。使用脂質(zhì)體將DNA帶人不同類型的真核細(xì)胞，與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復(fù)性。

中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電 的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。

二、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟

1、操作步驟[方法一]：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃CO2培養(yǎng)至40%~60%匯合時(shí)(匯合過(guò)分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。

(2) 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過(guò)高所致，應(yīng)酌情減量)。

(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

(4)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時(shí)，吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5)其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：

(1)以5×105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到50~60%板底面積。

(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在1mL無(wú)血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置5~10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3)棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無(wú)血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3~5小時(shí)。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14~24小時(shí)，

(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24~48小時(shí)。

(6)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1)接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2)、(3)步驟。

(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。

(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)