實時熒光定量PCR

1996年，實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美國Applied Biosystems公司首先推出，所謂Real-time qPCR是指在PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強(qiáng)弱的變化，即時分析目的基因的初始量，該技術(shù)的發(fā)明實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。

熒光化學(xué)物質(zhì)

目前根據(jù)Real-time qPCR所使用熒光化學(xué)物質(zhì)不同，將其分為熒光染料和熒光探針兩類。

熒光染料

熒光染料也稱DNA結(jié)合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

熒光染料的優(yōu)點(diǎn)：

1. 使用簡便；
2. 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合；
3. 價格便宜；

熒光染料的缺點(diǎn)：

1. 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA
2. 引物二聚體會影響檢測的敏感性
3. 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性

引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別，進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。

總的來說，SYBR Green I方法是一種最基礎(chǔ)也最cy的Real-time qPCR實驗手段。

熒光探針

Real-time qPCR中最cy的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針，該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。

正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時，引物與該探針同時結(jié)合到模板上，探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。

當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。

TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題，反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測，縮短了實驗時間。

TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：

1. 熒光背景低；
2. 敏感性高；
3. 雜交穩(wěn)定性高；
4. 熒光光譜分辨率好；
5. 特異性高。

TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn)：

1. 成本高；
2. 設(shè)計難度大；
3. 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。

由于TaqMan探針的高特異性，可用于等位基因的辨別，特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。

Real-time qPCR技術(shù)的定量原理

擴(kuò)增曲線

在Real-time qPCR中，對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實時的檢測并記錄其熒光信號，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線，即為擴(kuò)增曲線。

熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。

在Real-time qPCR擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化，此時即為基線期。

PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。

只有在熒光信號的指數(shù)增長期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。

熒光閾值

為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，首先需設(shè)定一個熒光信號的閾值，熒光閾值是在擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光閾值設(shè)置為3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，但實際應(yīng)用時要結(jié)合擴(kuò)增效率、線性回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮。

通常熒光閾值都是Real-time qPCR儀器自動設(shè)置，如無特殊情況，無需更改。

循環(huán)閾值

循環(huán)閾值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，Ct值與熒光閾值有關(guān)。

一般Ct值位于指數(shù)增長期的開始階段，此時樣品間細(xì)小物差尚未放大且擴(kuò)增效率也相對恒定，因此該Ct值具有ji好的重復(fù)性，盡管平臺期的DNA拷貝數(shù)波動很大，Ct值卻是相對固定的。

定量原理

對于一個理想的Real-time qPCR反應(yīng)：

對于一個非理想的Real-time qPCR反應(yīng)：

其中，n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，Xn為第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量，X0為初始模板量，E%為擴(kuò)增效率。

在Real-time qPCR中，在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值線時：

其中，XCt為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在熒光閾值設(shè)定以后，XCt為一個常數(shù)；

將上述公式兩邊取對數(shù)，并換算可得如下公式：

即Ct值與lgX0呈負(fù)相關(guān)，據(jù)此即可計算出樣本中所含的初始模板量。

Real-time qPCR的優(yōu)點(diǎn)

1. 特異性好，使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，具有很高的準(zhǔn)確性。
   同時，靶序列由引物和探針雙重控制，假陽性低。
2. 靈敏度高，Real-time qPCR技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測靈敏度很高。
3. 準(zhǔn)確性高、檢測范圍寬，由于熒光信號的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成線性對應(yīng)的關(guān)系，通過熒光信號的檢測可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量；定量范圍可在0-1010拷貝/毫升。
4. 操作簡單、安全、無污染，擴(kuò)增和檢測可以在同一管內(nèi)進(jìn)行，不需要開蓋，不易污染，同時擴(kuò)增和檢測一步完成，不需要后期處理，不再需要擔(dān)心放射性污染。
5. 速度快、通量高，可在2-3小時內(nèi)完成96個樣品的定量分析。