選擇合適丑組蛋白表達(dá)方法對于能否及時(shí)獲取所需數(shù)量和質(zhì)量的重z組蛋白非常關(guān)鍵。選擇了錯(cuò)誤的表達(dá)宿主可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊或低量表達(dá).缺少必要的翻譯后修飾或不適當(dāng)?shù)男揎?。選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)需騎慮的因素包括蛋白質(zhì)的大小、二硫鍵的數(shù)目、所需翻譯后修飾的類型及目標(biāo)蛋自質(zhì)的定位。純化后的重組蛋自的期應(yīng)用在決策過程中也是很關(guān)鍵的，其應(yīng)用領(lǐng)域有四大類:結(jié)構(gòu)研究、體外活性分析、作為抗原制備抗體和體內(nèi)研究。本章的目的是為研究者選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)提供指導(dǎo)。然而，即便憑借這些指導(dǎo)原則，很多倩況下仍然無法預(yù)先確定哪種表達(dá)系統(tǒng)是合適的，要想找到理想的表達(dá)系統(tǒng)，必須對多種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行嘗試。

目前，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界正在使用大量的表達(dá)系統(tǒng)。其中的一些表達(dá)系統(tǒng)非常新，并未經(jīng)過足夠的嘗試以評價(jià)其實(shí)用性。而且，一些已經(jīng)建立的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)(如轉(zhuǎn)基因動物），在技術(shù)上ji具挑戰(zhàn)性，需要消耗大量時(shí)間，并且極為昂貴,因此對于一般實(shí)驗(yàn)室而言并不是可行的選擇。就本章而言，我們只討論大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞及哺乳動物的表達(dá)系統(tǒng)(對這些表達(dá)系統(tǒng)更詳細(xì)的介紹見第12?15章）。這4類表達(dá)系統(tǒng)都有簡單易懂的操作方案，小量制備成本低廉，可以很容易從同行或科研產(chǎn)品公司（如Invitrogen、EMI>Novagen、Stratagene和Promega等）獲得。下面將會對這幾類表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)和可以進(jìn)行的選擇進(jìn)行簡要介紹,在此重點(diǎn)關(guān)注它們之間的不同之處。最后我們會介紹一些策略以幫助研究者選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。

大腸桿菌

大腸桿菌是最早用于重組蛋白表達(dá)的宿主菌，其在蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域仍被認(rèn)為是主要的工具。大腸桿菌較短的增殖時(shí)間使其成為一種簡單快捷的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。因此,評估重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)只需要不到1周的時(shí)間。培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基價(jià)格低廉，而且已有簡單直接的方法用于生產(chǎn)過程的放大(詳見第12章）。

在大腸桿菌中，重組蛋白通常定位于胞質(zhì)（cytoplasm)中，也可以定位于周質(zhì)(periplasm)，在少數(shù)情況下會分泌到胞外。定位于胞質(zhì)的蛋白質(zhì)的表達(dá)效率是*高的，其產(chǎn)量通?？梢哉伎偵镔|(zhì)(biomass)的3〇%(JanaandDeb,2〇〇5)。然而，重組蛋白過高的表達(dá)可能會導(dǎo)致不溶性蛋白聚集體的累積，從而形成包涵體Gndusi〇nSb〇dy)。不只是真核生物來源的蛋白質(zhì)會形成包涵體，少數(shù)情況下，包括大腸桿菌在內(nèi)的過表達(dá)原核生物來源的蛋白質(zhì)也會形成包涵體。在大腸桿菌中，蛋白質(zhì)翻譯和折疊的速率比在真核細(xì)胞中幾乎高1〇倍，這可能是真核蛋白質(zhì)形成包涵體的原因（Anderssonetal.，1982;GoustinandWilt，1982)。在某些情況下，包涵體大大妨礙了獲得可溶的活性蛋白質(zhì)。

不過，有時(shí)包涵體也能帶來好處，其不易被蛋白酶降解，易于離心濃縮，很少被其他蛋白質(zhì)污染，而且通過努力，也能將其再折疊成有活性的可溶性蛋白質(zhì)

1.大腸桿菌：溫度和分子伴侶

已經(jīng)有一些技術(shù)用于在胞質(zhì)中盡可能多地形成可溶的正確折疊的蛋白質(zhì)，而盡可能少地形成包涵體。最容易的方法是在蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)降低溫度至15?30°C(Sahdevetal.，2008)。據(jù)推測，降低溫度會降低蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯和折疊的速率，從而使蛋白質(zhì)能夠正確折疊（VeraetaL,2006)。此外，研究顯示，低溫還會降低熱休克蛋白酶（heatshockprotease)的活性(SpiessetaL,1999)。一些研究者通過在胞質(zhì)中與重組蛋白共表達(dá)分子伴侶(molecularchaperone)來促進(jìn)蛋白質(zhì)的可溶性(Youngetal.,2004)。該方法的運(yùn)用似乎具有蛋白質(zhì)特異性，因此需要針對每種目標(biāo)重組蛋白分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(BaneyxandMujacic，2004)。

2.大腸桿菌：融合標(biāo)簽

在重組蛋白的N端或C端融合可溶性的融合標(biāo)簽(fusiontag)是提高許多重組蛋白可溶性的另一種方法(EspositoandChatterjee,2006)。已經(jīng)證明能夠提高重組蛋白可溶性的融合標(biāo)簽包括谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶如glutathione-S-transferase,GST)、硫氧還蛋白（thioredoxin)、麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-bindingprotein，MBP)、小分子泛素樣修飾蛋白(smallubiquitin-modifier,SUMO)及NusA標(biāo)簽（JV-utilizationsubstrate)。其中GST標(biāo)簽和MBP標(biāo)簽還有另外的好處,可以用做親和純化的標(biāo)簽。然而令人遺憾的是沒有哪一種標(biāo)簽?zāi)軌蜻m用于所有的重組蛋白，必須對多種融合標(biāo)簽的促可溶表達(dá)能力進(jìn)行評估。有多種策略可用于移除重組蛋白的融合標(biāo)簽，廣泛的做法是在融合標(biāo)簽和重組蛋白之間插入蛋白酶酶切位點(diǎn)，然后使用特異性的蛋白酶將其切除。有時(shí)候，移除標(biāo)簽后重組蛋白可能會變得不可溶，所以必須對這一方法進(jìn)行謹(jǐn)慎的測試。

3.大腸桿菌：二硫鍵的形成

對于胞質(zhì)表達(dá)，大腸桿菌通常不能促使重組蛋白二硫鍵(disulfidebond)的正確形成；由于二硫鍵氧化還原酶系統(tǒng)(Dsbsystem)催化作用的存在,周質(zhì)通常是大腸桿菌中唯1可形成二硫鍵的場所(Andersenetal.，1997;Bardwell,1994)。因此，如果重組蛋白需要形成二硫鍵，就需要利用一個(gè)可切割的信號肽（如pelB)將其定位于周質(zhì)。然而，周質(zhì)表達(dá)的一個(gè)主要不利之處在于蛋白質(zhì)的表達(dá)量會大大降低。硫氧還蛋白（thioredoxin)和谷氧還蛋白（glutaredoxin)能夠促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)半腕氣酸的還原反應(yīng)，通過對大腸桿菌基因組的改造以破壞Dsb系統(tǒng)的硫氧還蛋白還原酶基因（thioredoxinreductasegene「trrB)和谷胱甘肽還原酶基（glutathionereductasegene,gor),就可以在胞質(zhì)內(nèi)創(chuàng)造更加適于二硫鍵形成的環(huán)境(Bessetteetal.，1999)。這些基因工程改造的菌株已由EMI>Novagen(Origami)公司實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。如果需要形成更多的二硫鍵，可以將重組蛋白與硫氧還蛋白融合后在trxB-/gor””大腸桿菌菌株中進(jìn)行表(LaVallieetaL，1993)。

4.大腸桿菌：翻譯后修飾

最后，必須認(rèn)識到相比于真核生物，大腸桿菌對蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾(posttranslationalmodification)的能力有限。例如，大腸桿菌不支持酶介導(dǎo)的N-連接的糖基化(iVlinkedglycosylation)、0連接的糖基化（Olinkedglycosylation)、酰胺化（amidation)、輕基化(hydroxylation)、豆蘧丑化（myristoylation)、棕櫚酰化(palmitoylation)和硫酸化(sulfation)

三、畢赤酵母

酵母作為另一種表達(dá)重組蛋白的強(qiáng)有力的傳統(tǒng)工具，已被成功應(yīng)用于大量蛋白質(zhì)的表達(dá)。酵母既具有大腸桿菌的許多優(yōu)點(diǎn)，如增殖時(shí)間短、基因組易于操作，又具有真核生物的優(yōu)勢，包括改善的蛋白質(zhì)折疊的能力和大部分的翻譯后修飾能力。第一個(gè)常規(guī)應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)的酵母菌株是釀酒酵母（SaccAarow^ycesceretw』siae)(StrausbergandStrausberg,2001)。然而，近15年來，畢赤酵母(Pz’c/iia和u‘fork)已經(jīng)成為酵母的shou選,因?yàn)樵摼曛亟M蛋白的表達(dá)水平高于釀酒酵母(詳見第13章）。畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母(methyltropicyeast),可利用甲醇作為其唯1的碳源（Creggetal.,1985)。畢赤酵母在含甲醇的培養(yǎng)基中生長，會導(dǎo)致其醇氧化酶(alcoholoxidase，A0X)和二羥丙酮合酶(dihydroxyacetonesynthase)基因發(fā)生強(qiáng)烈的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄（Cregg，2007)。經(jīng)過誘導(dǎo)，這些蛋白質(zhì)可以占到畢赤酵母總生物質(zhì)的30%。研究人員將醇氧化酶I(AOXl)的嚴(yán)密調(diào)控的強(qiáng)啟動子整合入大部分重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒用來驅(qū)動重組蛋白的表達(dá)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對該甲醇依賴基因誘導(dǎo)作用的利用（DalyandHeam,2005)。畢赤酵母的表達(dá)載體會整合到基因組中，而釀酒酵母的表達(dá)載體是游離復(fù)制(replicatingepisomally)的質(zhì)粒型表達(dá)載體，這種載體很不穩(wěn)定。利用畢赤酵母評估重組基因的表達(dá)需要3?4周，這包括酵母的轉(zhuǎn)化、篩選陽性整合的轉(zhuǎn)化子和蛋白質(zhì)的表達(dá)所需的時(shí)間。畢赤酵母一個(gè)能打動人的優(yōu)點(diǎn)是其在合適的培養(yǎng)條件下能夠獲得*的細(xì)胞密度(Cregg,2007)。只需使用成本低廉的培養(yǎng)基，畢赤酵母就能達(dá)到120g/L的細(xì)胞干重密度。需要重點(diǎn)注意的一點(diǎn)是，誘導(dǎo)用培養(yǎng)基中需要含有低百分比的甲醇，在大規(guī)模培養(yǎng)中，甲醇的量達(dá)到了產(chǎn)生火災(zāi)風(fēng)險(xiǎn)的程度，需要采取更高一級的安全措施。

畢赤酵母已經(jīng)用于獲取胞內(nèi)和分泌表達(dá)的蛋白質(zhì)。與其他真核生物一樣,它可以有效地形成二硫鍵，而且已經(jīng)成功用于表達(dá)含有多個(gè)二硫鍵的蛋白質(zhì)。為了便于分泌表達(dá),必須對重組蛋白進(jìn)行改造以使其攜帶信號肽序列。常用的信號肽是釀酒酵母的cr交配因子(a-matingfactor)的前-原(pre-pro)序列（DalyandHearn,2005)。由于畢赤酵母只分泌很少的內(nèi)源性蛋白，從培養(yǎng)基中純化重組蛋白是個(gè)相對簡單的工作。如果重組蛋白的酶解比較嚴(yán)重，可以利用Pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母菌株進(jìn)行表達(dá)(Gleesonetal.，1998)。該菌株具有較低的液泡肽酶A(vaCU〇kpeptidaseA)活性，該酶負(fù)責(zé)活化羧肽酶Y(carboxypeptidaseY)和蛋白酶BKproteaseBI)。

酵母具有翻譯后在特異的天冬酰胺殘基(N-連接)和絲氨酸/蘇氨酸殘基(〇■連接)添加聚糖(glycan)的能力。這些聚糖的結(jié)構(gòu)與昆蟲和哺乳動物細(xì)胞修飾添加的聚糖的結(jié)構(gòu)是很不相同的。在畢赤酵母中，N-連接的聚糖是高甘露糖(mannose)型的，通常有8?17個(gè)甘露糖，而釀酒酵母聚糖含有50?150個(gè)甘露糖殘基(Celiketal.，2007;GemmillandTrimble,1999)。與昆蟲和哺乳動物細(xì)胞相似的是，在酵母中N-連接聚糖的一致序列是Asn-Xaa-Ser/Thr。有兩個(gè)研究小組已經(jīng)通過全面的工程改造獲得了兩個(gè)畢赤酵母的菌株，它們能夠產(chǎn)生可以與哺乳動物細(xì)胞中相媲美的復(fù)雜的N-連接聚糖結(jié)構(gòu)（HamiltonandGerngross,2〇07)。然而,其他研究人員只能使用RolandContreras研究小組開發(fā)的菌株，而且必須得到ResearchCorporationTechnologies的許可。對畢赤酵母中O■連接聚糖的結(jié)構(gòu)研究還不很充分，但已知其是通過在絲氨酸/蘇氨酸殘基上添加1?4個(gè)甘露糖殘基形成的（Goto,2007;Trimbleetal.，20〇4)。已有數(shù)個(gè)報(bào)道指出，某些特定蛋白質(zhì)在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)會被添加O連接聚糖，而在哺乳動物細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)卻不會這樣（DalyandHearn，2005)。

四、桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞

在昆蟲細(xì)胞中由桿狀病毒(baculovirus)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)為重組蛋白制備提供了另外一種手段(詳見第14章）。桿狀病毒是一種裂解性的（lytic)、大的（130kb)雙鏈DNA病毒，其中桃木菌屬(Awi呀病毒是常用于重組蛋白表達(dá)的桿狀病毒。桿狀病毒通常在來源于秋天彳了軍蟲草地貪夜蛾（fallarmywormSpodopterafrugiperda)(Sf9、Sf21)的昆蟲細(xì)胞系中進(jìn)行增殖,而重組蛋白的表達(dá)既可在上述細(xì)胞系中完成，也可在來源于擬尺罐粉紋夜蛾（cabbagelooperTii)的細(xì)胞（HighFive)中進(jìn)行(Kostetal.，2〇〇5)。起初，構(gòu)建重組桿狀病毒的工作涉及將具有桿狀病毒

DNA側(cè)翼序列的目標(biāo)基因與桿狀病毒的DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞(insectcell),然后篩選出稀有的同源重組體。重組體的鑒定是通過篩選形態(tài)改變的空斑(plaque)來實(shí)現(xiàn)的，而且通常需要另外的多輪空斑篩選以確保制備的重組病毒中未污染有野生型病毒。這種耗時(shí)耗力的重組病毒制備方法在大多數(shù)時(shí)候已經(jīng)被位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座技術(shù)(Bac^to-Bac或BacuIoDirect,Invitrogen)和改良的同源重組技術(shù)(該技術(shù)使用在orfi629含有一個(gè)致死突變的工程桿狀病毒）（來自O(shè)xfordExpressionTechnologies的flashBAC,或來自EMD——No-vagen的BacMagic)所取代。因?yàn)槠渲亟M效率為*,這兩種方法都省略了分離空斑的操作。1輪或2輪的重組病毒擴(kuò)增后，研究人員可以使用空斑分析法、更新穎更快速的實(shí)時(shí)定量PCR法或基于抗體的分析法對桿狀病毒的濃縮液進(jìn)行定量（Hitchmanetal.，2007;Kwonetal.，2〇02)。重組桿狀病毒構(gòu)建和定量方法上的進(jìn)步已經(jīng)大大地減少了使用桿狀病毒進(jìn)行表達(dá)的時(shí)間—-縮短至大約3周，這其中包含為了優(yōu)化表達(dá)而耗費(fèi)的時(shí)間。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中常用的是polH啟動子和plO啟動子，二者均能在桿狀病毒感染的晚期經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的表(Ikonomouetal.，2003)。在此階段,細(xì)胞開始死亡，并伴隨著蛋白酶的釋放，這些蛋白酶可能會導(dǎo)致重組蛋白降解。為了減少重組蛋白的酶解，已經(jīng)使用了在細(xì)胞裂解周期中較早階段激活的啟動子，如基本啟動子（basicpromoter)(Ikonomouetal.，2003)。CA?A和1)——〇1執(zhí)基因分別編碼幾丁質(zhì)酶（chitinase)及一種組織蛋白酶(cathepsinprotease)，也可以通過構(gòu)建二者的基因缺陷型以盡量降低蛋白質(zhì)水解的作用（MonsmaandScott,1997)。

桿狀病毒介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)通常既能用于制備胞質(zhì)表達(dá)的重組蛋白，又能用于獲取分泌表達(dá)的重組蛋白。高效的分泌表達(dá)一般需要信號肽的參與。昆蟲和哺乳動物的信號序列都能引導(dǎo)重組蛋白進(jìn)入昆蟲細(xì)胞的分泌途徑。起初，昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)是在含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行，這使分泌蛋白的純化變得復(fù)雜。近來新研發(fā)的培養(yǎng)基允許使用動物組織或植物組織的蛋白質(zhì)水解液代替血清，從而大大簡化了蛋白質(zhì)的純化(Ikonomouetal.，2003)。不過，這種特殊的培養(yǎng)基造價(jià)高昂，限制了它在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。

昆蟲細(xì)胞能有效地在重組蛋白中形成二硫鍵，也能進(jìn)行絕大部分發(fā)現(xiàn)于哺乳動物細(xì)胞的翻譯后修飾。然而，大部分昆蟲細(xì)胞中形成的JV-連接聚糖都是巖藻糖苷寡甘露糖(fucosylatedpaucimannose)結(jié)構(gòu)（Man3GlcNAc2-N-Asn)(HarrisonandJarvis,2006;Jenkinsetal.，19%)。這一發(fā)現(xiàn)促使人們于最近構(gòu)建了能夠產(chǎn)生含有常見于哺乳動物細(xì)胞中的復(fù)雜N-連接聚糖的糖蛋白的昆蟲細(xì)胞系（HarrisonandJarvis,2006)。一個(gè)能夠表達(dá)數(shù)種糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因Sf-9昆蟲細(xì)胞系已實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化（MimiccelllineInvitrogen),其產(chǎn)生的N-連接聚糖包含一個(gè)雙觸須樣唾液酸化(sialylated)結(jié)構(gòu)。目前僅有幾篇文獻(xiàn)描述了昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的O連接聚糖的結(jié)構(gòu)(Chenetal.，1991;Sugyiamaetal.，1993;Thomsenetal.，2004)。

五、哺乳動物細(xì)胞

以前通常認(rèn)為哺乳動物表達(dá)方法是重組蛋白表達(dá)效lv最di的方法。然而，最近的研究進(jìn)展已經(jīng)大大地提高了哺乳動物細(xì)胞系的表達(dá)水平(詳見第15章)。例如,有報(bào)道稱利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)細(xì)胞，重組抗體的表達(dá)水平可以達(dá)到幾個(gè)毫克每升(Figueroaetal.，2007;Wurm,2004)。雖然目前已經(jīng)測試了多種細(xì)胞系和表達(dá)策略，但本章我們主要關(guān)注人胚腎（humanembryonickidney,HEK293)細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和CHO細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

HEK293細(xì)胞系來源于腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞。利用特定的轉(zhuǎn)染試劑，如陽離子脂質(zhì)體（cationiclipids)、憐酸耗（calciumphosphate)或聚乙烯亞胺（polyethyleneimine)，HEK293細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)較高的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率（>80%)(DurocheretaL,2002;JordanetaL,1996)。對于大規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(>i〇0mL)，相比陽離子脂質(zhì)體，以磷酸鈣或聚乙嫌亞胺作為轉(zhuǎn)染試劑是更加經(jīng)濟(jì)高效的選擇(BaldietaL，2007)。已經(jīng)有人進(jìn)行了生物反應(yīng)器級別的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，不過對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來說,這個(gè)規(guī)模在技術(shù)上還是很有挑戰(zhàn)性的(Girardetal.,2002)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)相對簡單，而且對于給定的重組蛋白，其評估可在2周內(nèi)完成。

當(dāng)需要大量的重組蛋白時(shí)，通常選擇CHO細(xì)胞作為哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。例如，當(dāng)前市場上大部分治療用抗體就是用該細(xì)胞系生產(chǎn)的。標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表達(dá)技術(shù)涉及使用具有二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase,DHFR)選擇標(biāo)記表達(dá)框和目標(biāo)基因表達(dá)框的載體轉(zhuǎn)染DHFR缺陷型的CH?細(xì)胞（Wurm，2004)。二氫葉酸還原酶能將二氫葉酸（dihydrofolate)還原為四氫葉酸（tetrahydrofolate)，后者對于嘌呤（purine)、特定的氨基酸和脫氧胸苷酸(thymidylicacid)的從頭合成是必需的。氨甲蝶呤(methotrexate)能結(jié)合并抑制DHFR，可作為選擇試劑使用，只有整合了DHFR選擇標(biāo)記表達(dá)框的細(xì)胞才能存活。連續(xù)提高氨甲蝶呤的濃度能造成DHFR基因及與其相連的目的基因的大量擴(kuò)增。經(jīng)過至少一輪的氨甲蝶呤篩選后,利用有限稀釋法將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆到多孔板中，就實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞群的亞克隆。通常的情況是，篩選得到的亞克隆中只有小部分能夠以較高的水平表達(dá)重組基因，因?yàn)榇蟛糠挚寺≈斜磉_(dá)框都整合到了轉(zhuǎn)錄不活躍的異染色質(zhì)區(qū)域。不幸的是，整個(gè)選擇和篩選的過程需要至少2?3個(gè)月，這是CHO表達(dá)方法最主要的缺點(diǎn)。不過，目前基于流式技術(shù)和自動化技術(shù)的高通量技術(shù)已經(jīng)大大簡化了高表達(dá)克隆的快速篩選和選擇(BrowneandAl-Rubeai，2007)。另外一個(gè)進(jìn)展是利用位于重組基因表達(dá)框兩側(cè)的特異性順式作用DNA元件(exactingDNAelement),它們可以使整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄變得活躍(KwaksandOtte，2006)。不幸的是，大部分此類DNA元件由公司擁有，實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)必須得到公司的許可。此外，即使有了上述的進(jìn)展，獲得高表達(dá)CHO克隆株需要的時(shí)間依然沒有太大的變化。

哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)主要用于制備分泌的重組蛋白，而不是制備胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)。已經(jīng)開發(fā)出了針對CHO和HEK293細(xì)胞系的無血清培養(yǎng)基,這使分泌表達(dá)的重組蛋白的純化變得簡單。不過,這種培養(yǎng)基價(jià)格不菲，使得大規(guī)模的生產(chǎn)非常昂貴。

相較于其他表達(dá)系統(tǒng)的宿主，哺乳動物細(xì)胞具有出色的蛋白質(zhì)折疊和二硫鍵形成能力。哺乳動物細(xì)胞生成的N-連接聚糖和0-連接聚糖的結(jié)構(gòu)變化很大，這不僅取決于蛋白質(zhì)，也與作為表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞的類型相關(guān)（Jenkinsetal.,1996)。此外，細(xì)胞的培養(yǎng)條件，如營養(yǎng)成分、pH、溫度、氧氣的水平以及氨濃度都能夠?qū)μ腔a(chǎn)生顯著的影響(Butler，2006)。JV-連接糖基化的糖會是寡聚甘露糖(〇lig〇mannose)、雜合聚糖及別的復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)，但所有的結(jié)構(gòu)都會包含—個(gè)Man3GlcNac2核心（BhatiaandMukhopadhyay，1998)。寡甘露糖聚糖有2?6個(gè)附加的甘露糖殘基，這些殘基可被磷酸化或硫酸化。常見的復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)具有2?4個(gè)連接于甘露糖的Gal，4-GlcNac2基團(tuán)，它能夠形成2個(gè)、3個(gè)和4個(gè)觸須樣的分支結(jié)構(gòu)。分支結(jié)構(gòu)末端為唾液酸，分支上還可連接巖藻糖。雜合聚糖同時(shí)具有寡聚甘露糖和復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)的特征^可根據(jù)其核心結(jié)構(gòu)將O連接糖基化結(jié)構(gòu)分為8類:0乙丑半乳糖胺型糖基化(〇GalNAc-typeglycosylation)、O-乙酰氨基葡糖型糖基化（OGlcNAotypeglycosylation)、O-巖藻糖基化（Ofucosylation)、O-甘?糖基化（Omannosyiation)、O-葡糖基化（Oglucosylation)、憐酸糖基化(phosphoglycosylation)、O-葡糖胺聚糖型糖基化（〇——glyc〇saminoglycan-typeglycosyiation)和膠原型糖基化（collagen-typeglycosylation)(Peter-Katalinic，2005)。

六、蛋白質(zhì)的特性

在選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí),可以很容易地通過文獻(xiàn)調(diào)研來確認(rèn)重組蛋白之前是否已被表達(dá)過并對公開出版的表達(dá)策略做出評估。借鑒文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)，考慮清楚文獻(xiàn)中重組蛋白的應(yīng)用目的與你的預(yù)期應(yīng)用是否相似或相容是很重要的。缺少文獻(xiàn)信息時(shí)，表達(dá)或詳細(xì)介紹同源蛋白的報(bào)道也是很有用的。在過去的十年，表達(dá)的蛋白質(zhì)的數(shù)目有了戲劇性地增加，這在一定程度上歸功于多種基因組序列的測定、高通量表達(dá)方法的發(fā)展以及大規(guī)模的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計(jì)劃（proteinstructureinitiative,PSI)。這種趨勢很可能會持續(xù)下去，這意味著最終前人的大量數(shù)據(jù)可以使表達(dá)系統(tǒng)的選擇變得更加簡單容易。

1.蛋白質(zhì)的特性：大腸桿菌與密碼子用法

—般來說，在重組蛋白表達(dá)宿主的選擇中，對原核來源的蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)只選擇大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，而不是真核表達(dá)系統(tǒng),因?yàn)橥ǔＵ婧松锏姆g后修飾能力和改善的折疊能力對原核蛋白來說是不必要的，甚至是不想要的。對于真核蛋白來說情況就不同了，因?yàn)橛写罅康膶?shí)例表明，真核蛋白能在大腸桿菌中進(jìn)行成功地表達(dá)（Sahdevetal.，2008)。當(dāng)使用原核系統(tǒng)表達(dá)真核蛋白時(shí)，一個(gè)非常重要的考慮是:像所有生物一樣，大腸桿菌對密碼子的使用有偏性，其tRNA豐度反映了這一?偏性（Gustafssonetal.，2004;Marin，2008)。表達(dá)含有數(shù)個(gè)大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白時(shí)會受對應(yīng)的tRNA豐度的限制而效率不高。tRNA短缺會導(dǎo)致翻譯移框、氨基酸錯(cuò)誤摻入及翻譯提前終止等。這個(gè)問題在稀有密碼子集中分布于N端時(shí)尤其明顯（Kane,1995)。不過,通過合成密碼子優(yōu)化的基因或者使用稀有密碼子tRNA豐度增加的商業(yè)化工程菌株（如Rosetta菌株，EMD——Novagen)可以避免這個(gè)問題。在多數(shù)情況下,如果重組基因是在親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的生物宿主中表達(dá),密碼子偏性也需要加以矯正。

2.蛋白質(zhì)的特性:胞質(zhì)蛋白

對于胞質(zhì)蛋白來說，選擇最佳的表達(dá)系統(tǒng)取決于蛋白質(zhì)的大小和分子內(nèi)二硫鍵的數(shù)目。對于分子質(zhì)量為10?50kDa并含有極少二硫鍵的蛋白質(zhì)而言，大腸桿菌是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的很好選擇（DysonetaL，2004)。對于更大或具有許多二硫鍵的蛋白質(zhì)來說，如果需要可溶性表達(dá)，那么通常應(yīng)優(yōu)先選擇桿狀病毒或酵母表達(dá)系統(tǒng)。對于10kDa以下，有極少甚至沒有二硫鍵的蛋白質(zhì)，已通過融合可溶性標(biāo)簽，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá)（EspositoandChatterjee,2006)。或者,也可以將這些小蛋白質(zhì)在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)(DalyandHearn,2005)。然而，在這一途徑中,必須小心監(jiān)測，因?yàn)檎Ｇ闆r下存在于胞內(nèi)的蛋白質(zhì)被強(qiáng)制進(jìn)入分泌途徑時(shí)可能出現(xiàn)無意產(chǎn)生的糖基化。這可以通過檢查序列確認(rèn)其不含一致的N-連接糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。遺憾的是，對于〇-連接糖基化，沒有保守序列，所以必須對分泌的重組蛋白進(jìn)行分析以確保其不含〇-連接聚糖。

3.蛋白質(zhì)的特性：分泌蛋白

所有的表達(dá)宿主都可用于生產(chǎn)分泌蛋白。不過，正如之前所述，大腸桿菌缺少大部分發(fā)現(xiàn)于真核生物中的翻譯后修飾功能。因此，大腸桿菌可能不適于表達(dá)分泌的真核蛋白，不過這也在很大程度上取決于下游的應(yīng)用。

4.蛋白質(zhì)的特性:膜蛋白

對于蛋白質(zhì)的大量表達(dá)來說，膜蛋白ji具挑戰(zhàn)性。在某些情況下，只表達(dá)可溶的、親水的部分就足夠了，此時(shí)可以移除跨膜結(jié)構(gòu)域，表達(dá)可溶部分。對于完整膜蛋白的表達(dá)，如何選擇最佳的表達(dá)系統(tǒng)還沒有明確的指導(dǎo)原則(Sarramegnaetal.，2003)。不過，對于大部分真核膜蛋白，由于在折疊和翻譯后修飾能力上的限制，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)通常不是一個(gè)很好的選擇。相對的，研究者已報(bào)道利用桿狀病毒和酵母表達(dá)系統(tǒng)在一定程度上成功地實(shí)現(xiàn)了G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)。

5.蛋白質(zhì)的特性:毒性蛋白

對表達(dá)宿主有毒的重組蛋白會給表達(dá)帶來挑戰(zhàn),不過這通常是可以克服的。如果重組蛋白有毒性，確定其毒性是否具有宿主細(xì)胞特異性通常是有用的。如果是的話，那么可以選擇在一個(gè)相容性更好的表達(dá)宿主中進(jìn)行表達(dá)。另一個(gè)選擇是使用嚴(yán)格調(diào)控的、可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)，如在大腸桿菌和畢赤酵母中應(yīng)用的那些表達(dá)系統(tǒng)。例如，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)個(gè)精確調(diào)控的可誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(Saida,2007)。在這些系統(tǒng)中，重組基因的表達(dá)由可誘導(dǎo)啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、質(zhì)?？截悢?shù)的控制或重組基因編碼序列的修飾來調(diào)控。在可用的畢赤酵母系統(tǒng)中，AOXl啟動子受誘導(dǎo)機(jī)制以及阻遏/去阻遏方法的聯(lián)合嚴(yán)格調(diào)控(DalyandHeam,2005)。另外，有數(shù)項(xiàng)研究表明桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng)可用于表達(dá)毒性蛋白（Aguiaretal.,2:006;KorthandLevings，1993)。最后，對于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)來說，jian單的選擇是瞬轉(zhuǎn)表達(dá)。CHO細(xì)胞中的數(shù)種可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)都需要花費(fèi)相當(dāng)多的時(shí)間以完成必要的細(xì)胞工程改造，而且利用這些表達(dá)系統(tǒng)很難獲得嚴(yán)格調(diào)控的基因表達(dá)，而這種嚴(yán)格調(diào)控對于防止細(xì)胞死亡來說是必需的(RossiandBlau,1998)。

七.重組蛋白的應(yīng)用

用于結(jié)構(gòu)研究時(shí)，重組蛋白的表達(dá)要求正確的蛋白質(zhì)折疊、形成正確的二硫鍵、均一的重組產(chǎn)物。前面已經(jīng)介紹了每種表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)折疊和二硫鍵形成的內(nèi)在能力。不均一性的潛在來源包括鱗酸化、甲硫氣酸氣膚酶(methionineaminopeptidase)對起始甲硫氨酸的低效切割以及糖基化。不幸的是,不均一的磷酸化常見于重組蛋白激酶的表達(dá),并且每一種表達(dá)宿主都有類似報(bào)道。在這種情況下,可以通過磷酸酶處理去除重組蛋白上的磷酸基團(tuán)以獲得均一性。當(dāng)重組蛋白在胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，可能會出現(xiàn)N端甲硫氨酸的不均一性。原核生物和真核生物都含有甲硫氨酸氨肽酶，甲硫氨酸的切割效率受起始甲硫氨酸相鄰的氨基酸的影響(Giglioneetal.,2004)。通常，該相鄰氨基酸側(cè)鏈的大小與甲硫氨酸切割的效率負(fù)相關(guān)。然而，在大腸桿菌中，高水平表達(dá)的重組蛋白會使酶達(dá)到飽和，并改變有效切割的相關(guān)規(guī)則(Dongetal.，1996)。這種不均一性可以通過小心選擇起始甲硫氨酸的相鄰氨基酸或利用N端的可切割的標(biāo)簽來避免。糖基化的不均一性可見于糖蛋白在所有真核生物中的表達(dá)。不過在昆蟲或酵母宿主中這種不均一性通常會低一些(Jenkinsetal.，1996)。無論采用何種表達(dá)宿主,通常會在試圖對重組蛋白進(jìn)行結(jié)晶前除去糖基團(tuán)。

正常情況下，若制備的重組蛋白用做免疫用抗原時(shí)，任何表達(dá)宿主都是可用的。對于糖蛋白來說，有時(shí)還不清楚聚糖的存在是否會改變重組抗原的免疫原性（BhatiaandMukhopadhyay,1998；Prasadetal.,1995)

適用于體外活性研究及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的重組蛋白的制備要求蛋白質(zhì)正確折疊和二硫鍵正確形成。對于糖蛋白來說，N-連接聚糖的存在以及聚糖基團(tuán)的結(jié)構(gòu)對這兩類應(yīng)用都有重要的影響，因此在選擇真核表達(dá)宿主時(shí)必須加以考慮。研究表明，JV-連接聚糖對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有積極的影響并增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(BhatiaandMukhopadhyay,1998)。在體外，已有研究顯示,某些蛋白質(zhì)配基上的N-連接聚糖的結(jié)構(gòu)會影響其與受體結(jié)合的親和力及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在重組免疫球蛋白中，F(xiàn)c區(qū)保守的N-連接聚糖影響了其在體外的效應(yīng)活性(Presta,2008)。例如，人IgGl的N-連接聚糖中巖藻糖的存在降低了抗體依賴的細(xì)胞毒性活性(Shinkawaetal.，2003)。在體內(nèi)，蛋白質(zhì)上N-連接聚糖結(jié)構(gòu)影響了其代謝清除和生物分布。例如，無唾液酸帽的N-連接聚糖會被肝受體(hepaticreceptor),清除這類受體包括脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體和甘露糖受體（WeigelandYik，2002)。O-連接糖基化的重要性還不明確。如果重組蛋白的糖基化修飾作用還不清楚，那么比較安全的策略是選擇與重組基因來源宿主相似的表達(dá)宿主。

八.結(jié)論

大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞及哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)重組蛋白方面各有其優(yōu)缺點(diǎn)(表11.1)。一個(gè)給定的表達(dá)系統(tǒng)能否高水平表達(dá)蛋白質(zhì)并獲得高質(zhì)量的產(chǎn)品,這在很大程度上取決于該蛋白質(zhì)。在選擇表達(dá)方法時(shí)，必須認(rèn)真地評估重組蛋白的特性及下游的應(yīng)用。不幸的是，有時(shí)候表達(dá)方法的選擇并不是顯而易見的，此時(shí)必須對數(shù)種表達(dá)宿主進(jìn)行評估。