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熒光分光光度計使用的時候存在兩種模式，一種是固定Ex掃Em，一種是固定Em掃Ex，將一個范圍的Ex（如230nm~300nm）的ex所對應的Em組合起來就是3D熒光。簡單的說，Ex是激發(fā)，也就是手電筒（光源），固定Ex的意思就是只用某個波長，如254nm作為光源來激發(fā)樣品，觀察的是固定該光源時，樣品在不同波長位置所展現(xiàn)的熒光強度（即em），簡單的說，就是看光屏上的強度。這一模式是為了了解待測物在哪個波段有光致發(fā)光現(xiàn)象。而Em，也就是被激發(fā)的光（就是接收器上接收到的），這是在知道了我的樣品在哪一個位置發(fā)光（被激發(fā)后發(fā)光）后，或者說，選定一個我需要的發(fā)光位置后，看看哪一個波長的光源對樣品激發(fā)效果更好。
一個是激發(fā)波長，另一個是發(fā)射波長。你得到一個新的樣品，你不知道它的激發(fā)波長，發(fā)射波長，那么辦呢。在前輩總結下，熒光分光光度計發(fā)現(xiàn)樣品的發(fā)射波長波動小，所以先確定發(fā)射波長。沒有激發(fā)波長激發(fā)，發(fā)射波長也得不到。一般熒光樣品的激發(fā)波長在300-410nm之間，你們可以查看同類物質的激發(fā)波長是多少，總結一下，在300—410nm中，先確定一個激發(fā)波長。在激發(fā)波長的激發(fā)下，出現(xiàn)熒光強度變化圖譜，熒光強度最大的那個點所對應的發(fā)射波長，即圖的橫坐標上的值，為發(fā)射波長。以發(fā)射波長確定最佳激發(fā)波長原則，熒光分光光度計以上面的發(fā)射波長為激發(fā)波長，再次得到一個光譜圖。在光譜圖中，同樣有一個最大熒光強度，這個強度所對應的發(fā)射波長就是你要找的最佳激發(fā)波長。所以會有兩條圖線，就有兩個波長。
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