支原體核酸能夠被檢出。這一方面數(shù)據(jù)可由廠家提供證明也可以根據(jù)實際情況進(jìn)行選材驗證；

非支原體DNA不會被檢出。一般選用系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較近的革蘭氏陽性細(xì)菌來驗證，包括Clostridium（梭菌屬）, Lactoacillus（乳酸菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）的細(xì)菌。但是在實際操作中，也會引入宿主細(xì)胞和實驗室常使用的表達(dá)菌株DNA進(jìn)行專屬性驗證，以確認(rèn)細(xì)胞基質(zhì)不會干擾結(jié)果判定。此外，由于支原體檢測實驗和操作環(huán)境都有的人源DNA氣溶膠存在，因此，也建議引入人源DNA進(jìn)行專屬性確認(rèn)，來排除檢測結(jié)果假陽性。

檢測限

檢測限指能夠檢測到的樣品中的The Lowest目標(biāo)支原體或核酸濃度，在設(shè)定濃度情況下進(jìn)行陰性/陽性確認(rèn)即可，不要求定量。從統(tǒng)計學(xué)角度要求95%檢測孔中能夠檢測為陽性的The Lowest支原體或拷貝數(shù)濃度即檢測限。

藥典NAT方法驗證中但是不限于使用如下支原體進(jìn)行方法學(xué)驗證，包含了制藥領(lǐng)域原輔料、操作人員等潛在污染源的代表性支原體類型。

實際驗證中，一般建議選取自己工藝中可能引入的支原體類型進(jìn)行驗證即可

• 如工藝中涉及血清使用，建議驗證精氨酸支原體和發(fā)酵支原體；

• 如果涉及貼壁細(xì)胞培養(yǎng)和胰酶使用，建議驗證豬鼻支原體；

• 如果涉及植物源原輔料，建議進(jìn)行柑橘頑固病螺原體驗證；

生產(chǎn)工藝中人一直會參與實驗操作，因此口腔支原體、肺炎支原體和唾液支原體都建議做驗證。

對于每種支原體，需要在不同天，至少各做3個稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個稀釋梯度做8個重復(fù)檢測或不同天各做 4個稀釋梯度，每個稀釋梯度做6次重復(fù)檢測，每個梯度的復(fù)孔數(shù)不低于24孔，以便統(tǒng)計學(xué)分析，并以95%陽性率結(jié)果進(jìn)行檢測限確定。也可以進(jìn)行前期摸索，確定一個大致陽性閾值點，然后在此濃度范圍附近進(jìn)行檢測限確認(rèn)，進(jìn)而減少工作量。

耐用性

耐用性指當(dāng)檢測方法參數(shù)有小的刻意變化時，檢驗結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據(jù)。耐用性的評估在方法開發(fā)階段就應(yīng)該被考慮，比如試劑中Mg²⁺、引物和dNTP的濃度，核酸提取步驟的變動以及不同核酸擴(kuò)增儀也是經(jīng)常用來評估的對象。與此同時，也建議耐用性考察盡量包括樣品保存方式，以及不同人員操作數(shù)據(jù)，來盡可能的減少檢測偏差。

以上為支原體檢測方法的驗證內(nèi)容。要替代藥典方法，還需要做靈敏度可比性研究，證明NAT方法的靈敏度不低于藥典現(xiàn)有方法，即不低于10 CFU/mL或100CFU/mL的靈敏度。有兩種方案可以用于可比性研究：

• 核酸檢測與藥典方法平行進(jìn)行，檢測并分析支原體LOD濃度情況下的檢出率；

• 將NAT方法的數(shù)據(jù)與此前藥典方法驗證的靈敏度數(shù)據(jù)對比。此種情況下，所用標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定及穩(wěn)定性都需要有明確的文件支持。

支原體NAT方法作為定性檢測，其驗證內(nèi)容相對定量檢測方法驗證來說較為簡單。但是從實質(zhì)上看，驗證復(fù)雜程度更大，而且考慮到標(biāo)準(zhǔn)品的來源、標(biāo)定、保存及稀釋檢測，本身就是一項復(fù)雜工作。

但是就像前面內(nèi)容所提到，支原體NAT方法本來就不能追求一次性完成，在BLA前完成完整驗證即可。而且，支原體檢測的本質(zhì)是盡早盡可能靈敏的發(fā)現(xiàn)污染，這種檢測不是通過一次性驗證能夠完成的，這是一項持續(xù)的過程，直到工藝步驟全部鎖定。

目前為止，已經(jīng)有很多企業(yè)使用MycoSEQ完成了NAT的方法驗證工作，并已經(jīng)用于產(chǎn)品的放行檢測。因此為MycoSEQ的使用積累了寶貴的經(jīng)驗和實踐基礎(chǔ)。