CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是包含單鏈RNA的sgRNA，利用與sgRNA的5'端互補的序列將Cas9蛋白引導至目標DNA位點。Cas9 Nuclease對目標DNA序列的PAM依賴性識別并在PAM區(qū)上游3bp的特定位點啟動DNA切割。

Cas9 Nuclease生成的雙鏈斷裂可通過NHEJ（Non-homologous end joining）或HDR（Homology directed repair）修復，NHEJ修復通常導致indel突變和基因失活，而HDR可以在提供供體模板時實現(xiàn)高保真的精確基因組編輯。由于生物體具有自我修復機制，隨著細胞復制分裂并修復切口，在修復的過程可能產生錯配，移碼突變、缺失突變，最后篩選出錯配純合子。

圖2：An overview of CRISPR/Cas9 mediated genome editing^[2]

? 如何減少和避免脫靶：
采用nick形式的Cas9 Nuclease加雙鏈sgRNA。

? sgRNA靶點的選擇：

Cas9 Nuclease切割位置在待修飾位點的30bp以內，Z差保持在50bp以內。

? sgRNA品質：

sgRNA活性是影響KI的關鍵因素之一，因此需要提前驗證其活性。

? Cas9 Nuclease形式的選擇：

縮短Cas9蛋白在細胞內的存續(xù)時間，可以避免連續(xù)切割和脫靶，建議使用mRNA或蛋白形式的Cas9。若采用質粒，需要確保其純度和濃度（建議大于1μg/μl）。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下簡稱“翌圣生物”）經過匠心研發(fā)，開發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設計的特異性DNA序列，可在單管反應4小時內獲得20-100μg具有功能的高品質的sgRNA，具有合成效率高、品質好、切除效率高等特點。

較高濃度的sgRNA關系到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果成敗，因此只有加入高濃度的sgRNA方能對基因的編輯起較好效果。翌圣生物開發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設計的特異性DNA序列，可在單管反應4小時內獲得20-100μg，*基因編輯的需要。

圖3：不同時間的sgRNA的合成量

對于sgRNA Synthesis Kit不僅要滿足產量上的要求，還需要針對不同種類的sgRNA合成也要達到相當高的產量，方能滿足不同類型基因的編輯需要，擴大試劑盒的應用范圍。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit經過多個種類的sgRNA的合成，其產量也是很高，可以滿足實驗所需，因此可以適應多種基因的編輯需要。

圖4：不同種類的sgRNA的合成量

在影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果成敗的關鍵因素中，合成的sgRNA的品質也是關鍵一環(huán)。因為合成的sgRNA的純度（即品質）不好，對編輯的效率會產生很大影響。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA經過安捷倫2100測定，其純度單一，說明品質較高，對后續(xù)的編輯效率會有很大提升。

圖5：合成的sgRNA的品質（安捷倫2100測定）

最后，所合成的高品質sgRNA是否有活性，需要實地測定才能發(fā)現(xiàn)其是否有活性，是否能夠與Cas9 Nuclease進行組合達到編輯基因的目的。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA與Cas9 Nuclease進行組合體外切割靶DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)所合成的sgRNA可以有效引導Cas9 Nuclease在特定位點切割并產生特定大小的DNA片段，因此具備活性。

圖6：sgRNA的剪切效率效果圖

翌圣生物為您提供高品質、高性價比的sgRNA合成試劑盒，讓您的CRISPR/Cas9科學研究及相關基因編輯應用如虎添翼，共同為人類的未來健康奉獻一份力量。

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【1】王晗月,楊曉菲,胡巢鳳,李富榮. CRISPR/Cas9基因編輯技術在糖尿病細胞治療中的應用研究進展[J]. 生命科學,2019,07:723-73.

【2】Lone BA, Karna SKL, Ahmad F, Shahi N, Pokharel YR. CRISPR/Cas9 System: A Bacterial Tailor for Genomic Engineering. Genet Res Int. 2018;2018:3797214. Published 2018 Sep 18. doi:10.1155/2018/3797214.