細菌呼吸鏈復合物4活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

    細菌呼吸鏈復合物4活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過細胞色素C氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中還原性細胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細菌裂解懸液呼吸鏈復合物IV的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細菌呼吸鏈復合物IV （Bacterial Complex IV），又稱為細胞色素氧化酶（cytochrome oxidase；EC1.9.3.1）或細胞色素bc1 復合物（Cytochrome bc 1 complex），存在于細菌細胞膜上，為呼吸臉上的終端酶，屬于含血紅素/銅終端氧化酶超級家族成員之一，與真核細胞線粒體復合物IV的核心結(jié)構(gòu)類似，含有I至III保留的核心亞體，細菌共有4個亞體，而線粒體共有13個亞體。在細菌有氧生長環(huán)境中，復合物IV為誘導性，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量。基于底物還原型細胞色素C（reduced cytochrome c），受到呼吸鏈復合物IV的催化，轉(zhuǎn)化為氧化型細胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現(xiàn)吸光值的變化（550nm 波長），由此定量測定呼吸鏈復合物IV的活性。呼吸鏈復合物IV反應(yīng)系統(tǒng)為： 

產(chǎn)品內(nèi)容

    緩沖液（Reagent A）         毫升

    反應(yīng)液（Reagent B）         毫升

    稀釋液（Reagent C）           毫升

    穩(wěn)定液A（Reagent D1）         管

    穩(wěn)定液B（Reagent D2）         微升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

    緩沖液（Reagent A）和    稀釋液（Reagent C）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；    反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的    穩(wěn)定液B（Reagent D2）置入冰槽里融化，然后移出xx微升到    穩(wěn)定液A（Reagent D1）管里，混勻后，標記為    穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的    反應(yīng)液（Reagent B）置入冰槽里融化；然后移出100微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升    穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15分鐘（可見顏色變化），置于冰槽里，標記為    反應(yīng)工作液（注意：見注意事項4），放在暗室里。然后進行下列操作。

一、 測讀準備

1． 準備好含有復合物IV的樣品，置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀：溫度25℃，波長550nm，間隔10秒，測讀7次（共60秒），并置零或設(shè)置0秒和60秒各測讀1次

3．     緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

二、 背景對照測定

1． 移取xx微升    緩沖液（Reagent A）到新的1毫升比色皿

2． 加入xx微升    稀釋液（Reagent C）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 室溫下孵育3分鐘

5． 加入xx微升含有    反應(yīng)液（Reagent B）和    穩(wěn)定液（Reagent D）的    反應(yīng)工作液

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），正常讀數(shù)差值為0.001至0.005

三、 樣品測定

1． 移取xx微升    緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升待測樣品（注意：建議總量50微克細菌蛋白）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 室溫下孵育3分鐘

5． 加入xx微升含有    反應(yīng)液（Reagent B）和    穩(wěn)定液（Reagent D）的    反應(yīng)工作液

6． 即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），通?；钚宰x數(shù)差值為正數(shù)

四、 計算樣品活性

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 線粒體樣品中忌用DTT和巰基乙醇等處理

4． 每增加1個樣品，增加    反應(yīng)工作液為：    反應(yīng)液（Reagent B）100微升＋    穩(wěn)定工作液3微升，以此類推。配制反應(yīng)工作液時，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實際工作液容量

5． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

6． 分光光度計波長嚴格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號

7． 加樣后3秒內(nèi)進行比色測定

8． 比色測定后，比色皿須清洗*

9． 比色皿背景空對照0秒讀數(shù)通常大于0.2為理想狀態(tài)；建議使用比色皿測定

10． 背景空對照的正常讀數(shù)差值（0秒－60秒）通常為0.001至0.005（正負即可）

11． 樣品0秒讀數(shù)通常和背景空對照0秒讀數(shù)一致

12． 樣本測定60秒讀數(shù)低于0秒讀數(shù)表明具有酶活性

13． 線粒體呼吸鏈復合物IV酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 8.0的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）氧化1微摩爾的細胞色素C

14． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供     Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 30030.1）

15． 本公司提供系列細菌復合物研究產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感