胰蛋白酶消化，質(zhì)譜法輕松鑒定蛋白質(zhì)，已經(jīng)是非常成熟的工作流程。即使是剛接觸MS的使用者也可以很快掌握。在質(zhì)譜法鑒定蛋白的工作流程中，蛋白質(zhì)鑒定是通過使用搜索引擎，例如 Mascot或Matrix Science進行簡單的數(shù)據(jù)庫搜索來實現(xiàn)的。然而，對于數(shù)據(jù)庫中未列出的蛋白質(zhì)鑒定需求，或需要進行蛋白質(zhì)末端序列分析的這兩種情況，通常采用更昂貴的高端儀器和更復(fù)雜的工作流程，需要熟練的操作員。此外，蛋白質(zhì)測序儀也通常用作蛋白質(zhì)末端序列分析的方法，但遇到 N 端封閉的蛋白質(zhì)，去封閉是必要的。作為樣品序列分析前的預(yù)處理，預(yù)處理效果取決于蛋白質(zhì)類型，可能效果不佳，對操作人員有一定要求，需要一定程度的技能和經(jīng)驗，這些可能會限制其使用。 

近年來，利用MALDI-TOF離子源（ISD：In-Source Decay）中發(fā)生的蛋白質(zhì)碎裂離子，可以分析N末端被封閉或未在數(shù)據(jù)庫中登記的蛋白質(zhì)序列MS圖譜。此外，ISD理論上不受每個樣品質(zhì)量的限制，因此無需胰蛋白酶消化即可直接對高質(zhì)量蛋白質(zhì)進行測序。結(jié)合電泳膠提取蛋白和島津臺式機MALDI-8020，通過N端封閉蛋白的分子量測定和序列分析的例子，讓我們來了解下大蛋白分子直接測序技術(shù)MALDI-ISD。

將模型樣品N 端被乙?；呐Ｌ妓狒?(Sigma-Aldrich)溶解在緩沖溶液中進行電泳， 95 °C 下加熱 5 分鐘，然后在聚丙烯酰胺凝膠（ATTO 12.5 %，預(yù)制 e-PAGEL）上進行電泳。所得聚丙烯酰胺凝膠用考馬斯亮藍染色以檢測蛋白質(zhì)斑點。使用含有表面活性劑的提取緩沖溶液，我們從凝膠分離的碳酸酐酶的條帶中提取蛋白質(zhì)。使用氯仿/甲醇在提取緩沖溶液中沉淀蛋白質(zhì)以去除表面活性劑和鹽，并使用 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀進行測量。芥子酸用作 MALDI 基質(zhì)用于蛋白質(zhì)分子量測量，1,5-二氨基萘 (DAN) 用于 ISD 的序列分析。

圖1、碳酸酐酶電泳圖

圖2、從凝膠中提取的碳酸酐酶MS圖（基質(zhì)芥子酸）

接下來，從25 pmol凝膠蛋白條帶中提取碳酸酐酶，與基質(zhì)DAN混合，MALDI-8020線性模式進一步分析。結(jié)果如圖3所示，主要檢測到c離子（從蛋白質(zhì)N段產(chǎn)生的片段）質(zhì)量一致的峰。通過使用免費軟件Mass++ TM和蛋白質(zhì)氨基酸序列比對工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，我們對從檢測到的峰中獲得的氨基酸序列進行了同源性搜索。

圖3、MALDI-ISD鑒定結(jié)果

鑒定結(jié)果顯示匹配結(jié)果最高的是碳酸酐酶。通過檢測到的c離子片段質(zhì)量和數(shù)據(jù)庫中已有的碳酸酐酶氨基酸序列，我們可以推斷出N段序列是SHHWGYGKH...，并且是N-乙酰化的。

MALDI-8020線性模式MALDI-ISD技術(shù)，無需復(fù)雜的工作流程，無需胰蛋白酶消化即可直接對高質(zhì)量蛋白質(zhì)（如本文所述m/z 29030示例）進行N端測序。

該方法在島津應(yīng)用專家與美國佛羅里達州立大學(xué)、日本愛媛大學(xué)高級研究支持中心生物醫(yī)學(xué)分析部、利物浦大學(xué)生化與系統(tǒng)生物學(xué)系等共同發(fā)表的一篇文獻中也有應(yīng)用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝膠的預(yù)分餾，實現(xiàn)質(zhì)譜法鑒定完整蛋白或蛋白復(fù)合物。凝膠分離回收14種人血清蛋白，提取后，用MALDI-8020的MALDI-ISD產(chǎn)生的產(chǎn)物離子鑒定人血清白蛋白N端氨基酸序列。

MALDI-8020是島津MALDI家族一款體積小巧，性能優(yōu)良的特色產(chǎn)品。榮獲2018 IBO工業(yè)設(shè)計大獎銀獎。

主要特點：

● 線性臺式MALDI-TOF

● 200Hz固態(tài)激光器，355nm波長

● 進樣速度快

● TrueClean™自動源清潔功能。配備大口徑離子光學(xué)系統(tǒng)，使儀器長期使用中源的污染風險降到最低。配備基于紫外激光器的源清潔功能，可自動快速實現(xiàn)源自清潔。

● 靜音（<55dB）

● 可視化工作狀態(tài)

參考文獻：

島津應(yīng)用新聞 No.B83

J. Proteome Res. 2020, 19, 3779−3791