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熊果酸別名又叫做烏蘇酸、烏索酸，是屬于有機(jī)三萜酸。其熔點(diǎn) 在254-257 攝氏度，是 羥基酸，易溶于熊果酸溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮、氯仿、丙酮等，不溶于水及石油醚。 味苦，有一定的光學(xué)活性，比旋光度 59（c=0.3，cyridine ）作用：近來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)熊果酸是 很好的免疫增強(qiáng)劑,具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)作用和抗致癌、抗促癌、誘導(dǎo) F9 畸胎瘤細(xì)胞分化和 抗血管生成、抗將血清軟氨酶、抗糖尿病等作用,且毒性小。所以熊果酸有望成為低毒有效 的新型抗癌藥。另外還具有明顯抗氧化功能，因而醫(yī)藥和化妝品原料、食品的乳化劑，具有 抗糖尿病作用。 熊果酸在藥用植物中分布廣泛,尤以枇杷葉中含量較高。枇杷葉是傳統(tǒng)的常用中藥 ,具有 止咳、清肺和胃、降氣化痰之功效。研究表明,枇杷葉中含皂苷、苦杏仁苷、熊果酸、齊墩 果酸、丁香素、枸櫞酸鹽、鞣質(zhì)、維生素 B1 和維生素 C 等。通過(guò)提取、分離、純化等步驟 制得熊果酸,工藝簡(jiǎn)便易行,為熊果酸的工業(yè)化生產(chǎn)和綜合利用枇杷葉資源提供了參考依據(jù)。
1 儀器與試劑 1.1 儀器 ES-C600 天平(湘儀天平儀器廠);超聲波振蕩儀(上海 Branson);RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 ;電熱恒溫水浴鍋; TG16-Ⅱ臺(tái)式離心機(jī) (長(zhǎng) 沙平凡儀器儀表有限公司);高效液相色譜儀(液相色譜儀用 HP agilent 1100,檢測(cè)器用紫外可 見(jiàn)檢測(cè)器, SEPU 色譜工作站 3000 )。
1.2 試劑 95%乙醇(武漢宏大化學(xué)試劑廠生產(chǎn),分析純,符合 GB679-94 標(biāo)準(zhǔn));甲醇(天津市科 密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心提供,色譜純);石油醚(60~90℃,天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心提供 ); 活性炭;熊果酸、齊敦果酸;枇杷葉,干燥,粉碎備用;水為蒸餾水、 離 子水。
2.1 提取 稱(chēng)取枇杷葉粉末[過(guò) 20 目篩, 100g 置于燒杯中,用 8 倍量 95%乙醇超聲提取 3 次, 每次 30 min。合并 3 次提取液,過(guò)濾除去殘?jiān)?減壓回收乙醇,得浸膏。 20 目篩 枇杷葉、粉碎、烘干 乙醇回流提取 趁熱過(guò)濾 溶劑濃縮得浸膏 石油醚 24h 浸提 NaOH 溶液水洗 無(wú)水乙醇 洗出液（無(wú)色) 溶解 活性炭 過(guò)濾 熱乙醇 放冷靜置 結(jié)晶 白色片狀 加熱 熱乙醇 重結(jié)晶 溶解 回流脫色 反復(fù)洗殘?jiān)?熊果酸粗品 高效液相
2.2 純化 將浸膏依次用石油醚、1%氫氧化鈉水溶液、水洗至洗出液近無(wú)色,烘干。再用無(wú) 水乙醇加熱溶解,加活性炭回流脫色 20min,濾過(guò)。用熱乙醇反復(fù)洗滌殘?jiān)?,合并濾液及洗液, 蒸去部分乙醇,放冷,靜置,得白色片狀結(jié)晶;過(guò)濾,濾餅加入乙醇,加熱煮沸,趁熱過(guò)濾,濾渣反復(fù) 用乙醇重結(jié)晶得白色針狀結(jié)晶。 圖 1.提取熊果酸的原則工藝流程
2.2.1 大孔吸附樹(shù)脂層析法 大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)不含離子交換基團(tuán)的交聯(lián)聚合物，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿 及有機(jī)溶劑，對(duì)有機(jī)物有濃縮、分離作用且不受無(wú)機(jī)鹽及離子、低分子化合物的干擾。它的 吸附作用通過(guò)表面吸附、表面電性或形成氫鍵而完成。大孔吸附樹(shù)脂與有機(jī)物的作用力主要 為范德華引力與氫鍵。 采用大孔吸附樹(shù)脂富集柱和大孔吸附樹(shù)脂純化柱串聯(lián)的方法分離 純化熊果酸。富集柱優(yōu)先吸附熊果酸以除去大量雜質(zhì)，使熊果酸的純度從 28.05%提高到 85.0%以上，再用純化柱除去熊果酸中的部分雜質(zhì)，使熊果酸的純度進(jìn)一步提高到 95.0%以 上。分步洗脫富集柱時(shí)發(fā)現(xiàn)，50%以下的乙醇溶液可以有效除去雜質(zhì)，而熊果酸則可用 pH 為 10 的 80%乙醇溶液解吸，解吸率為 98.0%以上。在 pH 為 10 的 80%乙醇溶液中，純化柱 對(duì)雜質(zhì)的吸附率為 98.76%，而對(duì)熊果酸的吸附率僅為 0.05%。 洗脫劑組合，即水一 20%乙醇一 50%乙醇一 52%乙醇一 80%乙醇(pH=10)，每一段洗 脫劑的體積分別為:50，50，150，100，100ml。將富集柱熊果酸的解吸過(guò)程與純化柱雜質(zhì)的 吸附過(guò)程串聯(lián)即可達(dá)到純化熊果酸的目的。富集柱和純化柱再生容易，經(jīng)過(guò)再生后，樹(shù)脂的 吸附率均可恢復(fù)到 98%以上;大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)以其*的優(yōu)勢(shì)廣泛用于中草藥化學(xué)成分的 分離純化，主要用于水溶性物質(zhì)的分離，如水溶性生物堿、黃酮類(lèi)化合物、昔類(lèi)化合物、皂 昔類(lèi)化合物、多酚類(lèi)或酸性化合物、糖類(lèi)、維生素、色素等。
2.3 高效液相色譜法 高效液相色譜用于熊果酸分離測(cè)定具有快速、高效、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。用于熊果酸分析 的高效液相色譜柱的固定相為 C18，即十八烷基鍵合相硅膠，流動(dòng)向以甲醇一水體系為主。 甲醇與水的比例變化較大，從 80:20~97:3 不等。采用甲醇一磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，熊果 酸進(jìn)樣量在 0.251 一 10.0409 呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，最小檢出限 (信噪比 )3)為 0.1509(HP 一 1050DAD 檢測(cè)器)。HPLC 法檢測(cè)器大多使用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)在 210~220nm 之間。熊 果酸甲醇溶液紫外吸收的最大波長(zhǎng)為 204nm， 但甲醇在此波長(zhǎng)下亦有很強(qiáng)的背景吸收，為減 少干擾，一般選擇 215lun~220nln 作為熊果酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。HPLC 法測(cè)定熊果酸的含量已經(jīng) 得到長(zhǎng)足的發(fā)展，采用調(diào)節(jié)流動(dòng)相的 pH 值和加入鹽等手段以改善色譜峰峰形和分離度，提 高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。
總之，HPLC 法用于熊果酸測(cè)定具有快速、高效和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，因此，本研究選用 HPLC 法作為分析檢測(cè)手段。 ①色譜條件: 色譜條件:Hypersi1C: ，色譜柱(250nunx4.6mm，10 靦);流動(dòng)相:甲醇一水一磷酸 二氫鈉一二乙胺(88:12:0.20:0.02(v/v));流動(dòng)相用微濾膜過(guò)濾后，超聲脫氣處理 20min;檢測(cè)波 長(zhǎng)入=220nm;流速 0.5ml/min;柱溫為 25℃，檢測(cè)靈敏度為 0.04。 ②對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的配制:精密稱(chēng)取熊果酸對(duì)照品用甲醇配制成濃度為 1mg·mL-1 的對(duì) 照品溶液， 搖勻， 再做梯度稀釋為 20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1，125μg·mL-1 的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。一進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、 峰面積為縱坐標(biāo)，電腦繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其回歸方 程：Y=19.22652X-18.19440,R=0.99904. ③提取溶液的配制:精密稱(chēng)取 0.229g 結(jié)晶Ⅰ,甲醇溶解并定容至 25 mL,得供試品 1。精密量取 供試品 1 及對(duì)照品溶液混合。 ④高效液相分析:分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品 1,在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜 分析,在保留時(shí)間為 17. 292 min 處出現(xiàn)一單峰。 用面積歸一化法計(jì)算供試品 1 的峰面積為 94. 15%。
本實(shí)驗(yàn)除雜過(guò)程中,由于熊果酸不溶于水和石油醚,所以分別用水和石油醚去除水溶性和 脂溶性雜質(zhì)。以 60~90℃的石油醚洗,先浸泡 2 min 再抽濾,濾液棄去,濾渣繼續(xù)同法洗數(shù)次直 至濾液幾近無(wú)色。通過(guò)實(shí)驗(yàn), 1%氫氧化鈉水溶液可以洗去一些酸性物質(zhì)但洗不去熊果酸。用 水洗時(shí),加水沉降 12 h 后抽濾,同樣洗至濾液近無(wú)色。比較沒(méi)洗的和洗后的樣品的高效液相 圖 譜,洗過(guò)的樣品明顯雜質(zhì)峰已去掉,只有甲醇的溶劑峰和齊墩果酸以及熊果酸的峰。 在重結(jié)晶過(guò)程中,用活性炭水浴脫色,過(guò)濾后放置有白色片狀物析出,濾出結(jié)晶濾液中仍 有少量淡黃色的固體析出,但晶形不好,且高效液相色譜測(cè)定圖譜顯示后析出的這些固體中齊 墩果酸的含量漸漸增高。所以用熱甲醇重結(jié)晶時(shí)可以分離兩種酸但損失產(chǎn)品。另外 ,加入的 活性炭也會(huì)吸附產(chǎn)品,造成損失;提取過(guò)程中的轉(zhuǎn)移除雜等步驟也會(huì)有損失。在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定 的枇杷葉中熊果酸的含量為 9. 987 mg·g-1,而最后提取得率只約有 40%,約損失了 60%,但由 于絕對(duì)含量較高,所以以枇杷葉為原料提取熊果酸是可行的,更好的方法有待進(jìn)一步研究。 在對(duì)熊果酸方法進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究后建立的這套提取工藝是而且時(shí)間 和根據(jù)理論來(lái)講最切合實(shí)際的提取方案。在提取過(guò)程中還可以借助超聲波輔助提取，隨著科 學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步， 現(xiàn)代高新提取技術(shù)有了快速發(fā)展， 超聲波輔助提取技術(shù)具有省時(shí)、 節(jié)能 、 對(duì)有效成分損害小、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代藥物生產(chǎn)中備受關(guān)注。相關(guān)文章：在迷迭香植物中提取熊果酸對(duì)照品的工藝方法
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