雙抗體夾心法檢測(cè)抗原

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法，但要注意的是在一步法（待測(cè)抗原與酶標(biāo)抗體一起加入反應(yīng)）測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復(fù)合物”出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類(lèi)試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。

雙抗體夾心法的簡(jiǎn)要操作步驟為：
1）先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面；
2）再加樣品，使目標(biāo)檢測(cè)抗原形成抗原-抗體復(fù)合物；
3）加酶標(biāo)抗抗體（第二種動(dòng)物抗抗原的酶標(biāo)抗體）；
4）加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗原的量成正比。

競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原

當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。方法的基本原理可見(jiàn)圖2，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

競(jìng)爭(zhēng)法的簡(jiǎn)要操作步驟：
1）先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面；
2）加入梯度濃度比例的待測(cè)樣品與酶標(biāo)抗原混合物,同時(shí)做只加酶標(biāo)抗原的對(duì)照組；
3）加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的顯色差異，計(jì)算未知抗原的量。

雙抗原夾心法檢測(cè)抗體

雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類(lèi)似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。

雙抗原夾心法的簡(jiǎn)要操作步驟為：
1）先加入抗原，使抗體固定結(jié)合于載體表面；
2）再加樣品，使目標(biāo)檢測(cè)抗體形成抗原-抗體復(fù)合物；
3）加酶標(biāo)抗原；
4）加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比。

間接法檢測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體（人免疫球蛋白），故稱(chēng)為間接法。本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。

間接法的簡(jiǎn)要操作步驟：
1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原；
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗-體復(fù)合物；
3）加酶標(biāo)抗抗體；
4）加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比。