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蛋白純化過程中哪些因素會影響沉淀?

來源:浙江聯(lián)碩生物科技有限公司   2021年09月13日 13:56  
生物分子的分離純化是獲得有效生物產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié)之一,在重組蛋白純化過程中需要考慮目的物性質(zhì),合理選擇及組合具有各自特點及優(yōu)勢的層析技術(shù),才能達到*的純化效果,滿足目標產(chǎn)品產(chǎn)量、純度等多方面的要求。蛋白的分離純化及制備過程中,會產(chǎn)生沉淀,這些沉淀有可逆和不可逆2種。


蛋白發(fā)生變性,指的是蛋白分子在遭到劇烈的物理化學(xué)(如高溫、pH等)作用時,分子中的次級鍵遭到破壞斷裂,導(dǎo)致空間構(gòu)象從緊密有序的變?yōu)樗缮o序的狀態(tài),這種清況下形成的沉淀是不可逆的。在蛋白鹽析、蛋白等電沉淀中最為常見的是蛋白質(zhì)的水化膜遭到破壞或者中和了表面的凈電荷后形成的沉淀,這種情況下形成的沉淀是可逆的,利用這一特性可以用來分離純化蛋白。


若發(fā)生可逆沉淀后,可以嘗試通過增加溶劑,調(diào)節(jié)pH,添加助溶劑等方式來處理;若發(fā)生不可逆沉淀,則可以選擇離心,過濾等方式去除。一般下列因素會影響蛋白純化過程中沉淀的形成。

1、影響蛋白純化過程中沉淀形成的影響因素
(1)蛋白自身性質(zhì)
如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易發(fā)生疏水聚合而沉淀,做過膜蛋白提取以及包涵體溶解時都有切身體會。在表達還有二硫鍵鍵的蛋白時特別容易形成包涵體蛋白,所以蛋白的氨基酸序列中,含硫氨基酸較多時也容易形成沉淀。

(2)pH值
蛋白質(zhì)大多數(shù)都在高pH時溶解性高,低pH時易沉淀,這可能與氫鍵的形成有關(guān)。但有時候更低pH時蛋白又溶解了,這一現(xiàn)象在我們用親和層析純化抗體時特別常見。鹽濃度就是鹽析效應(yīng),高濃度的鹽破壞蛋白的水化層,使得蛋白質(zhì)聚集沉淀,常用的就是硫酸銨沉淀。鹽析沉淀通常對蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)沒有破壞,再溶時活性可以*恢復(fù)。常見的例子就是硫酸銨沉淀純化IgG。同樣,硫酸銨沉淀也常碰到不可逆的情況,例如大腸桿菌(Escherichiacoli)表達的重組蛋白往往在硫酸銨沉淀后再溶困難。

(3)有機溶劑
例如丙酮沉淀,但有機溶劑也不是全部對蛋白起沉淀作用,有時候也有助溶作用。例如有些膜蛋白的有機溶劑抽提。

(4)溫度
高溫或低溫都有可能使得蛋白質(zhì)沉淀。煮沸沉淀常見了,低溫沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。

(5)表面活性劑
對蛋白質(zhì)有助溶作用。例如做電泳的SDS就是很強的表面活性劑,還有TWEEN,Triton等等。

(6)還原劑
還原劑往往對蛋白質(zhì)有助溶作用。有些蛋白當(dāng)加入的還原劑在空氣中慢慢氧化后,就會沉淀析出。變性劑如尿素、鹽酸胍,包涵體蛋白在用變性劑溶解后,再去除變性劑經(jīng)常會沉淀析出。

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