50270.1 v.A

  細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放黃色對硝基苯胺，產(chǎn)生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動物、人體等）尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又稱為尿激酶（urokinase；UK），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細(xì)胞外基質(zhì)和尿液中。尿激酶由411氨基酸構(gòu)成，分子量為54KD，有3個結(jié)構(gòu)域：絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和生長因子結(jié)構(gòu)域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細(xì)胞蛋白水解過程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細(xì)胞外基質(zhì)降解等。uPA與組織重構(gòu)、修復(fù)、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴散有關(guān)。uPA的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰對硝基苯胺）受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

uPA

p-EGR-pNA-HCl       →          p-EGR-OH  +   pNA

                                       （黃色）

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）        120毫升

  裂解液（Reagent B）         10毫升

  緩沖液（Reagent C）          2毫升

  陰性液（Reagent D）            1毫升

  底物液（Reagent E）          220微升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品制備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入3毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入200至500微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品

2． 設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零

三、 活性測定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2． 分別移取85微升  緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入5微升  陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

4． 分別加入10微升  底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動96孔板（注意：避免氣泡）

6． 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）

7． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測

8． 活性計算：

（1） 酶標(biāo)儀檢測

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 60（反應(yīng)時間；分鐘）X 0.3（光徑距離；厘米）]＝單位/毫升 

轉(zhuǎn)換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

（2） 比色皿檢測

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 60（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉(zhuǎn)換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

注意事項

1． 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融

5． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)60分鐘

6． 比色測定后，比色皿須清洗*

7． 樣本測定60分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

8． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長反應(yīng)孵育時間至16小時；其次增加樣本量（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

10． 尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾三肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作為一個活性單位

11． 本公司提供系列細(xì)胞蛋白酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感